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針對(duì)上述問(wèn)題，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第四人民醫(yī)院鄭加麟/談扉團(tuán)隊(duì)受臨床術(shù)式與藥物靶向遞送啟發(fā)，構(gòu)建了一種“雙模”iNSC-Exo治療平臺(tái)：對(duì)需開顱的重型TBI，將外泌體載入3秒可注射、28天緩釋的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠（iNSC-Exo@Gel），實(shí)現(xiàn)損傷腔原位91%持續(xù)釋放；對(duì)輕中型TBI，則用狂犬病毒糖蛋白R(shí)VG修飾外泌體，靜脈給藥后腦內(nèi)富集度提高2倍。單細(xì)胞測(cè)序顯示，兩種途徑均激活小膠質(zhì)細(xì)胞亞群Microglia_Nrg3/Rarb的NRXN-Nlgn1軸，重建神經(jīng)元-小膠質(zhì)突觸連接，從而統(tǒng)一解釋跨場(chǎng)景療效，為TBI提供兼顧手術(shù)與非手術(shù)患者的“通用型”外泌體精準(zhǔn)治療新范式。該文章于2025年9月24日以《Clinically Inspired Multimodal Treatment Using Induced Neural Stem Cells-Derived Exosomes Promotes Recovery of Traumatic Brain Injury through Microglial Modulation》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI: 10.1002/advs.202508574）。

（1）神經(jīng)球和外泌體的表征表明 iNSC-Exo 和 NSC-Exo 之間具有很強(qiáng)的相似性

為了評(píng)估外泌體對(duì) TBI 恢復(fù)的治療效果，分離了 NSC-Exo 和 iNSC-Exo 用于臨床前研究（圖 1A）。在懸浮培養(yǎng)中，NSC 和 iNSC 產(chǎn)生的神經(jīng)球都表現(xiàn)出球形形態(tài)（圖 1B）。這些神經(jīng)球?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物 Nestin（紅色）和 SOX2（綠色）呈陽(yáng)性（圖 1C）。NSC-Exo 與 iNSC-Exo 均呈典型杯狀/橢圓形態(tài)，粒徑分別為 102 nm 與 150 nm（圖 1D-E）；神經(jīng)球 Nestin/SOX2 雙陽(yáng)性（圖 1C）。CD81、CD63、CD9 高表達(dá)。PKH26 標(biāo)記顯示兩種外泌體均可被 BV2（圖 1F）及 PC12有效攝取，胞漿內(nèi)熒光均勻分布；iNSC-Exo 攝取量與劑量呈正相關(guān)。

圖1 神經(jīng)球與外泌體的表征。(a) NSC-Exo與iNSC-Exo分離流程示意圖；(b) 增殖條件下NSC與iNSC形成神經(jīng)球的明場(chǎng)照片；(c) NSC與iNSC中SOX2和Nestin免疫熒光共標(biāo)；(d) TEM顯示NSC-Exo與iNSC-Exo呈杯狀或橢圓形態(tài)；(e) NSC-Exo與iNSC-Exo的粒徑分布；(f) PKH26標(biāo)記的NSC-Exo及iNSC-Exo（紅色）被BV2細(xì)胞攝取，DAPI染核（藍(lán)色）

（2）iNSC-Exo 和 NSC-Exo 均抑制神經(jīng)炎癥并改善體外軸突生長(zhǎng)

LPS刺激使BV2細(xì)胞M1標(biāo)志物（CD86、TNF-α、iNOS）升高、M2標(biāo)志物（CD206、TGF-β、IL4）降低；NSC-Exo與iNSC-Exo共培養(yǎng)后M1下調(diào)、M2上調(diào)，TNF-α蛋白減少、IL4增加（圖2B-C）。劃痕損傷PC12細(xì)胞中，NSC-Exo及iNSC-Exo均提升Nestin、NF-200、GAP-43轉(zhuǎn)錄水平并顯著延長(zhǎng)神經(jīng)突長(zhǎng)度，二者促軸突再生效應(yīng)相當(dāng)（圖2E-G）。

圖2 NSC-Exo與iNSC-Exo體外抑制神經(jīng)炎癥并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。(a) BV2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程示意圖；(b) Q-PCR檢測(cè)M1/M2標(biāo)志物CD86、TNF-α、iNOS、CD206、TGF-β、IL-4表達(dá)（n=6）；(c) 流式細(xì)胞術(shù)定量TNF-α與IL-4蛋白水平（n=6）；(d) PC12細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)示意圖；(e) Q-PCR檢測(cè)GAP-43、NF-200、Nestin轉(zhuǎn)錄水平（n=6）；(f) GAP-43免疫熒光代表圖及(g)神經(jīng)突長(zhǎng)度量化（n=50）

（3）開顱手術(shù)后并使用可注射水凝膠可以實(shí)現(xiàn)外泌體局部遞送至 TBI 缺損

CMCS/SA/GDL 水凝膠 20 °C 下 547±98 s 完成原位成膠，孔隙互通，CMCS 氨基與 SA 羧基形成 3D 網(wǎng)絡(luò)；初始分解溫度 175 °C，4 周內(nèi)腦內(nèi)完全降解且無(wú)炎癥反應(yīng)。載外泌體 28 d 累計(jì)釋放 91.45±16.27%，植入組熒光信號(hào)持續(xù)至第 21 天，顯著優(yōu)于單純注射組，實(shí)現(xiàn)外泌體長(zhǎng)效滯留。

（4）局部遞送 iNSC-Exo 可保護(hù)小鼠 TBI 后血腦屏障，減少腦水腫，促進(jìn)功能恢復(fù)

為了全面驗(yàn)證使用注射水凝膠（iNSC-Exo@Gel）局部遞送的 iNSC-Exo 的治療效果，進(jìn)行了一系列神經(jīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)（圖 3A）。術(shù)后第7天，iNSC-Exo@Gel與NSC-Exo@Gel均降低EB滲出量并減少腦水含量，H&E顯示損傷面積縮?。▓D3B–E、H）。平衡木與轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)示，兩治療組錯(cuò)步率持續(xù)下降，轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間升至TBI組的1.5倍（圖3F–G）。Iba-1、GFAP表達(dá)下調(diào)，GAP-43、DCX上調(diào)，提示炎癥抑制與軸突再生；肝腎功能指標(biāo)及主要臟器組織學(xué)無(wú)異常。

圖3 開顱注射水凝膠遞送外泌體。(a) 建模-給藥-行為測(cè)試流程；(b) 術(shù)后7天EB滲出代表圖及(c) 定量（n=3）；(d) 腦水含量（n=3）；(e) 28天H&E缺損區(qū)；(f) 平衡木錯(cuò)步率（n=6-9）；(g) 轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間（n=6-9）；(h) 損傷面積量化（n=3)

（5）RVG 改良策略通過(guò)體內(nèi) TBI 小鼠大腦的全身給藥增強(qiáng) iNSC-Exo 富集

靜脈注射后，RVG-iNSC-Exo在腦內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度于各時(shí)間點(diǎn)均高于未修飾iNSC-Exo，24與48 h離體腦半定量顯示其腦蓄積量提升約2倍（圖4A-D）；主要外周分布仍為肝、脾、肺（圖4E-G）。DiD/FITC雙標(biāo)結(jié)果顯示RVG-iNSC-Exo與Iba-1陽(yáng)性微膠質(zhì)細(xì)胞共定位，證實(shí)其被腦內(nèi)微膠質(zhì)細(xì)胞攝?。▓D4H）。

圖4 RVG修飾提升iNSC-Exo腦富集。(a) 靜脈注射后0.5–96 h活體腦DiD熒光；(b) 離體腦及主要器官24、48、96 h熒光圖；(c) 腦熒光強(qiáng)度量化（n=5）；(d) 腦離體半定量（n=3）；肝、脾、肺等器官24 h (e)、48 h (f)、96 h (g)熒光強(qiáng)度；(h) Iba-1（紅）共定位顯示RVG-iNSC-Exo-FITC（綠）/DiD（黃）被微膠質(zhì)細(xì)胞攝取

（6）全身給予 RVG 修飾的 iNSC-Exo 可改善小鼠 TBI 后運(yùn)動(dòng)功能，增加認(rèn)知能力，增強(qiáng)認(rèn)知恢復(fù)

RVG-iNSC-Exo組轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間及握力評(píng)分均高于未修飾組與TBI組（圖5B–C）。Morris水迷宮5日訓(xùn)練中，RVG-iNSC-Exo組逃避潛伏期最短，空間策略占比提高，第6天探查試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限停留時(shí)間與平臺(tái)穿越次數(shù)均優(yōu)于TBI組（圖5D–H）。海馬LFP顯示，RVG-iNSC-Exo恢復(fù)θ、γ波段功率至對(duì)照水平（圖5I–K）。組織學(xué)：RVG-iNSC-Exo組 lesion 面積縮小，組織結(jié)構(gòu)完整，主要臟器無(wú)毒性改變。

圖5 RVG-iNSC-Exo靜脈給藥提升TBI小鼠運(yùn)動(dòng)與認(rèn)知恢復(fù)。(a) 實(shí)驗(yàn)時(shí)間軸；(b) 轉(zhuǎn)棒成績(jī)（n=6–9）；(c) 握力評(píng)分（n=6–9）；(d) 水迷宮學(xué)習(xí)期逃避潛伏期（n=6–9）；(e) 搜索策略分布；(f) 游泳軌跡圖；(g) 目標(biāo)象限停留時(shí)間與(h) 平臺(tái)穿越次數(shù)（n=6–9）；(i) 海馬LFP功率譜；(j) 時(shí)頻圖；(k) θ、γ波段功率量化（n=3）

（7）單細(xì)胞測(cè)序顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞是 TBI 小鼠大腦中受 iNSC-Exo 治療影響的主要細(xì)胞類型

損傷后第30天皮層-海馬snRNA-seq共獲113 802個(gè)細(xì)胞，分11型，iNSC-Exo組神經(jīng)再生、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)通路在三群神經(jīng)元中顯著上調(diào)（圖6A-C）。細(xì)胞比例顯示iNSC-Exo提高微膠質(zhì)、少突膠質(zhì)與星形膠質(zhì)占比，Augur確定微膠質(zhì)變化最顯著（圖6D-E；圖S13）。微膠質(zhì)進(jìn)一步劃分為Microglia_Nrg3、Mbp、Rarb、Atp1a2、Trem2五群，特征基因表達(dá)見UMAP（圖6F-G）。

圖6 單核測(cè)序顯示iNSC-Exo主要影響微膠質(zhì)。(a) UMAP展示11種細(xì)胞類群（n=9，3組各3例）；(b) 各型標(biāo)記基因點(diǎn)圖；(c) GSVA示3群神經(jīng)元再生/學(xué)習(xí)記憶通路活性；(d) 細(xì)胞類型比例柱狀圖；(e) Augur AUC值棒棒糖圖突出微膠質(zhì)變化最大；(f) 五色UMAP劃分5個(gè)微膠質(zhì)亞群；(g) 各亞群特征基因表達(dá)UMAP圖

（8）分化狀態(tài)降低的Microglia_Nrg3 和Microglia_Rarb 亞群通過(guò) iNSC-Exo 治療介導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)功能

偽時(shí)序分析顯示Microglia_Nrg3與Microglia_Rarb位于分化軌跡起始端，TBI組該兩群密度增高而iNSC-Exo組恢復(fù)至對(duì)照水平（圖7A-C）。CytoTRACE得分最高證實(shí)其低分化特性（圖7E），差異表達(dá)分析亦顯示該兩群變化最顯著（圖7F）。GO/KEGG富集表明cluster 1基因集中于突觸與軸突信號(hào)通路，相關(guān)基因在偽時(shí)序早期高表達(dá)（圖7G-H）。

圖7 低分化Microglia_Nrg3/Rarb介導(dǎo)iNSC-Exo修復(fù)。(a) Monocle偽時(shí)序軌跡（上：亞群，下：時(shí)間）；(b) 三組微膠質(zhì)密度galaxy圖；(c) 軌跡分組；(d) 偽時(shí)序基因表達(dá)ridge圖及四簇?zé)釄D；(e) CytoTRACE分化狀態(tài)；(f) iNSC-Exo vs TBI差異基因；(g) cluster 1 GO/KEGG氣泡圖；(h) 突觸/軸突基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)

（9）iNSC-Exo 治療可通過(guò)激活 NRXN 信號(hào)通路改善小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的突觸連接

CellChat顯示iNSC-Exo組微膠質(zhì)-神經(jīng)元互作數(shù)最高，Microglia_Nrg3/Rarb為主要信號(hào)發(fā)送者，傳遞強(qiáng)度優(yōu)于TBI組（圖8A–B）。NRXN-Nlgn1與NRG-Erbb4通路在TBI后減弱、iNSC-Exo后增強(qiáng)，信號(hào)流差異顯著（圖8C–E）。配體-受體互作圖證實(shí)Microglia_Nrg3/Rarb通過(guò)Nrxn1-3及Nrg1-3與神經(jīng)元突觸蛋白結(jié)合，作用強(qiáng)度回升（圖8F）。GSVA示該兩群神經(jīng)再生、發(fā)育及自噬功能上調(diào)；SCENIC鑒定Bclaf1、Foxp2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控NRXN/NRG，其regulon活性在iNSC-Exo組顯著升高（圖8G–H）。

圖8 iNSC-Exo激活NRXN通路增強(qiáng)微膠質(zhì)-神經(jīng)元突觸連接。(a) 細(xì)胞互作數(shù)差異熱圖；(b) 信號(hào)收發(fā)強(qiáng)度變化；(c) Microglia_Nrg3/Rarb信號(hào)差異；(d) NRXN與NRG互作網(wǎng)絡(luò)；(e) 三組通路信號(hào)流堆疊圖；(f) Microglia_Nrg3→神經(jīng)元分子 dot 圖；(g) GSVA 示三群神經(jīng)元通路活性；(h) SCENIC 構(gòu)建 NRXN/NRG 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)