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為了解決上述挑戰(zhàn)，浙江大學陳鳴宇、Sarun Juengpanich及蔡秀軍教授團隊開發(fā)了一種聲敏性（TPEN）包載的靶向癌細胞納米顆粒（STCNs），用于誘導內(nèi)源性銅死亡并增強HCC的免疫治療。STCNs通過葉酸受體介導的內(nèi)吞作用特異性靶向HCC細胞，并在超聲激活下釋放TPEN。TPEN作為銅螯合劑，能從超氧化物歧化酶中移除Cu²⁺，增加細胞內(nèi)Cu²⁺水平，進而通過類芬頓反應產(chǎn)生活性氧并升高Cu⁺水平。這種氧化應激破壞了細胞防御機制，誘導內(nèi)源性銅死亡，同時產(chǎn)生的ROS激活I(lǐng)CD，刺激樹突狀細胞成熟和T細胞浸潤，從而將HCC免疫抑制性的“冷”腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)化為免疫原性的“熱”腫瘤狀態(tài)。該策略利用STCNs實現(xiàn)時空可控的內(nèi)源性銅死亡誘導，克服了銅離子載體的局限性，顯著提高了HCC的免疫治療效果。該文章于2025年7月20日以《Targeted Intracellular Copper Reservoir Enhances Liver Cancer Immunotherapy》為題發(fā)表于《Small》（DOI：10.1002/smll.202502783）。

圖1. 研究示意圖

（1）STCN的合成與表征

NU-1000、NT及TPEN@NT納米顆粒均呈現(xiàn)紡錘形且尺寸均一（圖2a），經(jīng)SCPLs包覆后形成的STCNs在超聲作用下由簇狀分布轉(zhuǎn)變?yōu)殡x散顆粒。元素分析證實STCNs中Zr、C、O、N、S均勻分布（圖2b）。動態(tài)光散射測試表明TPEN@NT包覆后Zeta電位由+38.36 mV降至-36.42 mV，流體力學尺寸由125 nm增至200 nm（圖2c-d）。紅外光譜在1700 cm^-1和1171 cm^-1處分別檢測到C-N鍵和PEG鏈特征峰（圖2e），X射線衍射證實材料結(jié)晶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖2f）。穩(wěn)定性實驗顯示STCNs在生理環(huán)境中4周內(nèi)保持穩(wěn)定（圖2g）。藥物釋放測試表明TPEN在超聲72小時后釋放率達89%（圖2i），活性氧檢測顯示STCNs與TCNs均具有顯著的聲動力活性（圖2j-k）。

圖2 STCNs的表征。（a）NT、TPEN@NT和STCNs在有無超聲照射下的透射電子顯微鏡（TEM）圖像；（b）STCNs的成像及能量色散譜（EDS）映射；（c）NT、TPEN@NT和STCNs的ζ電位；（d）NT、TPEN@NT和STCNs的粒徑分布；（e）SCPLs、NT、TPEN@NT和STCNs的傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析；（f）NU-1000、NT、TPEN@NT和STCNs的X射線衍射譜；（g）STCNs在PBS中的穩(wěn)定性測試，指定時間間隔（0、7、14、21、28天）的粒徑分布；（h）STCNs在有無超聲照射下的TCPP熒光強度；（i）STCNs的體外藥物釋放曲線；（j）STCNs在超聲照射下的DPBF吸光度譜變化；（k）STCNs/TCNs在超聲照射下的相對DPBF峰吸光度

（2）STCN的細胞攝取和細胞毒性

STCNs在肝細胞癌（HCC）細胞HuH-7和Hepl-6中的攝取情況，結(jié)果表明STCNs在細胞內(nèi)的濃度隨時間增加，在24小時達到峰值（圖3a）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，腫瘤細胞內(nèi)的STCNs逐漸積累在細胞質(zhì)中（圖3b）。在超聲照射下，STCNs在HCC細胞系中的細胞毒性顯著高于正常肝細胞AML-12（圖3c）。STCNs與US聯(lián)用時，對Hep1-6和HuH-7細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）顯著降低，表明其抗腫瘤作用的協(xié)同效應（圖3d）。STCNs組在超聲照射下表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，而SCNs組未顯示明顯的增殖抑制（圖3e）。此外，STCNs在其他腫瘤模型中也顯示出良好的細胞毒性，表明其在臨床應用中的潛力（圖3f）。

圖3 STCNs與HCC細胞的相互作用及抗腫瘤活性。（a）不同時間點Hep1-6或HuH-7細胞對STCNs的攝取熒光圖像；（b）不同時間點Hep1-6或HuH-7細胞對STCNs的冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）圖像（紅箭頭指示STCNs）；（c）不同濃度TPEN或STCNs處理48小時后Hep1-6或HuH-7細胞的CCK-8實驗結(jié)果；（d）不同濃度SCNs或超聲照射5分鐘下的SCNs處理48小時后Hep1-6或HuH-7細胞的CCK-8實驗結(jié)果；（e）正常培養(yǎng)基、TPEN、SCNs或STCNs在有無超聲照射下處理48小時后Hep1-6或HuH-7細胞的CCK-8實驗結(jié)果；（f）正常培養(yǎng)基、TPEN、SCNs或STCNs在有無超聲照射下處理48小時后NOZ或PNAC細胞的CCK-8實驗結(jié)果

（3）STCNs內(nèi)源性銅中毒機制及ICD效應

TPEN釋放后，與Cu²⁺結(jié)合，失活SOD，并激活Fenton樣反應，產(chǎn)生ROS和Cu+，消耗細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，導致脂?；疍LAT形成不溶性復合物，阻斷線粒體功能，誘導細胞死亡。STCNs聯(lián)合US照射可降低GSH水平，促進銅死亡，并激活抗腫瘤免疫（圖4a）。STCNs與US聯(lián)合應用顯著降低了SOD活性、Cu水平，并消耗了GSH，且TPEN等效劑量下的SOD活性和Cu水平顯著低于STCNs+US組（圖4b）。STCNs+US處理顯著降低了腫瘤細胞的FDX1表達和DLAT脂?；迯土司€粒體功能，并誘導了細胞形態(tài)變化（圖4c）。RNA測序顯示，STCNs+US處理與對照組相比，基因表達存在差異，特別是與免疫應答相關(guān)的基因上調(diào)，表明STCNs+US能夠激活抗腫瘤免疫（圖4d）。STCNs+US處理顯著增加了促使抗原呈遞、促進免疫反應的DAMPs（包括CRT、HMGB1、ATP）水平，并提高了CD86和CD80的表達，表明STCNs+US能夠促進樹突狀細胞（DCs）成熟，激活免疫系統(tǒng)，有效消除腫瘤（圖4e）。

圖4 STCNs誘導內(nèi)源性銅死亡和免疫原性細胞死亡的評估。（a）STCNs誘導內(nèi)源性銅死亡機制的示意圖；（b）Hep1-6細胞在不同處理條件下的超氧化物歧化酶（SOD）活性；（c）Hep1-6細胞中銅的相對水平；（d）Hep1-6細胞中谷胱甘肽（GSH）的相對水平；（e）Hep1-6細胞中OLI-DLAT、DLAT、β-Actin和FDX1的Western blot結(jié)果；（f）Hep1-6細胞內(nèi)活性氧（ROS）的觀察；（g）Hep1-6細胞中ROS的相對值；（h）Hep1-6細胞中CRT和HMGB1的免疫熒光圖像；（i）Hep1-6細胞中細胞外ATP水平的測定；（j）ICD觸發(fā)樹突狀細胞成熟的示意圖

（4）STCN的療效評價及免疫應答激活

TCNs聯(lián)合超聲治療組（17.5 mg/kg，1.0 W/cm2超聲）顯著抑制皮下HCC小鼠腫瘤生長，腫瘤體積最?。▓D5a-c）；該組中位生存期延長至74天（PBS組38天），且未引起明顯體重異常（圖5d）。免疫熒光顯示STCNs+US顯著激活腫瘤免疫微環(huán)境（圖5e）。聯(lián)合PD-1抑制劑后，腫瘤體積進一步減小，協(xié)同增效作用顯著（圖5f-g）。

圖5 STCNs的治療效果及免疫反應激活評估。（a）治療效果評估的實驗流程示意圖；（b）不同組別在皮下HCC模型治療期間的腫瘤體積變化；（c）治療21天后不同組別的腫瘤圖像；（d）不同組別小鼠皮下HCC模型的生存曲線；（e）不同處理后腫瘤組織中CD45+細胞和CD8+ T細胞的熒光圖像；（f）結(jié)合STCNs與α-PD1的治療效果評估示意圖；（g）不同組別在皮下HCC模型治療期間的腫瘤體積變化

（5）STCN的腫瘤靶向能力、生物分布和生物安全性

STCNs在注射后不同時間點（1, 4, 8, 12, 24, 36 h）的體內(nèi)熒光成像，顯示STCNs在腫瘤部位的滯留能力和靶向能力，以及在肝臟、腎臟和腫瘤中的主要分布（圖6a）；STCNs治療40天后，與健康小鼠相比，血細胞參數(shù)無顯著變化（圖6b）；STCNs治療40天后，肝功能檢測結(jié)果無顯著變化（圖6c）；STCNs治療40天后，主要器官（腎臟、脾臟、肺、心臟、肝臟）的H&E染色切片未顯示明顯異常（圖6d）。

圖6 STCNs的腫瘤靶向能力、生物分布和生物安全性。（a）不同時間點從小鼠收集的腫瘤及其他器官的熒光圖像；（b）健康小鼠每周靜脈注射30天后進行血液學分析；（c）健康小鼠每周靜脈注射30天后進行血液生化分析；（d）STCNs體內(nèi)毒理學的H&E染色分析