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針對上述問題，上海交通大學(xué)霍云龍教授團(tuán)隊設(shè)計的LNP - mRNA系統(tǒng)在體內(nèi)生成的瞬時FAP靶向CAR - T（FAPCAR - T）細(xì)胞的治療活性，并探索在博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中的肺再生機(jī)制。該團(tuán)隊開發(fā)了一種新型LNP-mRNA系統(tǒng)，并在博來霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中驗(yàn)證了其肺再生機(jī)制。研究假設(shè)認(rèn)為，持續(xù)的纖維化積聚會通過支持炎癥環(huán)境和改變細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）硬化并阻礙肺部再生。為驗(yàn)證該假說，該團(tuán)隊對BLM誘導(dǎo)肺纖維化的年輕/老年小鼠模型進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和單細(xì)胞測序（scRNA-seq）的全面分析。結(jié)果顯示，ECM硬化會抑制II型肺泡上皮細(xì)胞（AT2）向I型肺泡上皮細(xì)胞（AT1）的分化，從而損害肺泡結(jié)構(gòu)的自我修復(fù)能力。LNP-mRNA療法不僅消除了肺纖維化，還通過改善ECM環(huán)境增強(qiáng)了AT2和Pclaf+細(xì)胞的可塑性，成功挽救了AT1細(xì)胞群。此外，肺部免疫功能通過Apoe+巨噬細(xì)胞重建，并伴隨效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量的增加而恢復(fù)?？傮w而言，優(yōu)化后的LNP-mRNA系統(tǒng)在體內(nèi)成功生成FAPCAR-T細(xì)胞，清除肺纖維化病灶，并促進(jìn)肺部修。該文章于2025年4月21日以《Targeted immunotherapy rescues pulmonary fibrosis by reducing activated fibroblasts and regulating alveolar cell profile》為題發(fā)表于《Nature communications》（DOI：10.1038/s41467-025-59093-7）。

圖1. LNP-mRNA治療肺纖維化及相關(guān)機(jī)制

（1）通過CD5/βLNP-mRNA系統(tǒng)產(chǎn)生的FAPCAR-T細(xì)胞

通過用等量的β-谷甾醇替換膽固醇來提高轉(zhuǎn)染效率（圖2A）。先前的研究提出，β-谷甾醇可以促進(jìn)脂質(zhì)顆粒的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸。不同比例的β-谷甾醇與LNP（0-40%）對LNP的物理特性影響不大。測試了在不同β-谷甾醇濃度下，經(jīng)過24小時孵育后，293T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中熒光素酶mRNA的表達(dá)。含有30% β-谷甾醇和10%膽固醇的LNP表現(xiàn)出最高的mRNA表達(dá)，并被定義為βLNP。透射電子顯微鏡（TEM）掃描顯示，βLNP和CD5修飾的βLNP（CD5/βLNP）之間沒有顯著差異，兩者都具有約4納米的雙層膜和含有密集核苷酸的核心區(qū)域（圖2B）。

體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA包含5'帽子結(jié)構(gòu)、優(yōu)化的UTR結(jié)構(gòu)域、Kozak序列、修飾的poly(A)尾和編碼CAR序列的ORF結(jié)構(gòu)域（圖2C）。除了傳統(tǒng)的帶有CD28跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）的CAR設(shè)計外，還引入了一種新的TMD設(shè)計，遵循可編程膜蛋白（proMP）策略。先前的研究表明，來自CD28的跨膜片段有可能招募額外的共刺激信號，這可能導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞的過度激活。這種效應(yīng)在癌癥治療中可能是有益的，但在非腫瘤應(yīng)用中可能導(dǎo)致不必要的細(xì)胞激活和細(xì)胞因子釋放。成纖維細(xì)胞激活蛋白（FAP）是激活成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物。在博萊霉素給藥后14天和28天，檢測到肺組織中FAP的高表達(dá)（圖2D）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，設(shè)計了兩種FAP靶向CAR序列，分別帶有CD28 TMD（FAPCAR 2.1）和優(yōu)化的TMD（FAPCAR 2.2）。

經(jīng)過24小時共孵育后，CD5/βLNP-mRNA與原代小鼠T細(xì)胞的FAPCAR 2.1/2.2在T細(xì)胞膜上的表達(dá)率約為80%（圖2E）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與僅表達(dá)FAP的靶細(xì)胞共培養(yǎng)時，瞬時FAPCAR-T細(xì)胞的溶解能力取決于效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例（E:T）（圖2F）。此外，與CD5/βLNP-FAPCAR 2.1相比，CD5/βLNP-FAPCAR 2.2導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放減少了約30%，而沒有改變?nèi)芙饽芰Γ▓D2G），表明優(yōu)化的TMD的優(yōu)越性，使其更適合用于肺纖維化。此外，CD5/βLNP主要在脾臟和肝臟中累積，而IgG/βLNP僅在肝臟中累積，這表明CD5/βLNP具有靶向脾臟的能力（圖2H）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一點(diǎn)，在注射后24小時對小鼠的脾臟進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CD5/βLNP主要與T細(xì)胞（CD3e陽性）共定位，很少與B細(xì)胞（CD19陽性）或樹突狀細(xì)胞（DCs，CD11c陽性）共定位。此外，部分CD5/βLNP與F4/80陽性巨噬細(xì)胞共定位，這表明外源性LNP被巨噬細(xì)胞吞噬（圖2I，S2D）。隨后，對小鼠進(jìn)行了不同劑量的熒光素酶mRNA表達(dá)分析。在脾臟和肝臟中，注射量越大，表達(dá)量越高；然而，這些器官中的表達(dá)在96小時后被系統(tǒng)性清除（圖2J，S2E）。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析了FAPCAR mRNA在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果顯示，在注射10μg的CD5/βLNP-FAPCAR后24小時，約3%的原代T細(xì)胞被編程為FAPCAR-T細(xì)胞，這比生理鹽水注射組顯著增加（圖2K）。CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療在體內(nèi)成功生成了FAPCAR-T細(xì)胞。

圖2. A.傳統(tǒng)和β-谷甾醇修飾的靶向LNP（βLNP）結(jié)構(gòu)示意圖。B. βLNP和帶有CD5表面修飾的βLNP（STEM圖像）的膜結(jié)構(gòu)。C. FAPCAR 2.1和FAPCAR 2.2 IVT mRNA示意圖。優(yōu)化的TMD替換了FAPCAR 2.2序列中的CD28 TMD。D. 博萊霉素建模后0、14和28天小鼠肺中FAP的IHC染色。箭頭：FAP陽性過度激活的成纖維細(xì)胞。E. 經(jīng)過24小時與IgG/βLNP或CD5/βLNP共孵育后，小鼠T細(xì)胞表面FAPCAR 2.1和FAPCAR 2.2受體的表達(dá)。F. 經(jīng)過36小時共培養(yǎng)后，瞬時CAR-T與3T3細(xì)胞的靶向溶解實(shí)驗(yàn)。G. 經(jīng)過48小時共培養(yǎng)后，F(xiàn)APCAR-T與FAP-3T3細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生（效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞比例=10:1）。 H. 注射后24小時，用PKH26標(biāo)記的βLNP在小鼠脾臟和肝臟中的分布。I. 注射后24小時，脾臟中CD5/βLNP（紅色）與CD3e陽性T細(xì)胞（綠色）的共定位。J. 不同劑量下，βLNP在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染后熒光素酶mRNA的劑量和時間依賴性分布和表達(dá)變化。K. 與生理鹽水注射相比，注射10微克CD5/βLNP后24小時，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FAPCAR 2.1和2.2 mRNA的表達(dá)

（2）CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療逆轉(zhuǎn)肺纖維化

通過CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療成功在體內(nèi)生成了FAPCAR-T細(xì)胞。隨后在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中評估了其抗纖維化反應(yīng)。博萊霉素模型的小鼠分別接受CD5/βLNP-FAPCAR 2.2、IgG/βLNP-FAPCAR 2.2或生理鹽水處理。治療組還在術(shù)后第7天和第14天接受了商業(yè)基準(zhǔn)藥物吡非尼酮（PFD，100 mg/kg/天）的口服給藥（圖3A）。蘇木精-伊紅染色顯示，從術(shù)后第7天起肺纖維化和肺泡異常開始出現(xiàn)，并隨著纖維化的進(jìn)展逐漸加重（圖S3A）。CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，小鼠體重和肺系數(shù)迅速恢復(fù)，存活率在所有接受博萊霉素手術(shù)的組中最高（圖3B–D）。在CD5/βLNP組（而不是在生理鹽水或PFD組）中，在術(shù)后第15天觀察到CD3+T細(xì)胞的積累（圖S3B）。為了觀察轉(zhuǎn)染情況，在FAPCAR mRNA中生成了tdTomato報告基因。在脾臟和纖維化的肺部，可檢測到共表達(dá)CD3和tdTomato的T細(xì)胞（圖3E），這為CD5/βLNP轉(zhuǎn)染和FAPCAR-T細(xì)胞浸潤纖維化肺組織提供了證據(jù)。此外，流式細(xì)胞術(shù)顯示，CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，小鼠脾臟和肺部的FAPCAR陽性T細(xì)胞數(shù)量增加（圖3F，S3C，D），而IgG/βLNP治療或健康小鼠中則沒有。重要的是，CD5/βLNP組的FAP陽性成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而PFD治療對這一指標(biāo)沒有影響（圖3G，S3E）。根據(jù)肺纖維化評估的標(biāo)準(zhǔn)指南，術(shù)后第28天對動物進(jìn)行微計算機(jī)斷層掃描（CT）分析。影像學(xué)結(jié)果表明，博萊霉素+生理鹽水組在肺部區(qū)域出現(xiàn)區(qū)域?qū)嵶兒蛷浡躁幱?，肺部的Hounsfield單位（HU）密度增加，而這些癥狀在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后顯著緩解（圖3H）。重建的3D肺模型顯示，治療后纖維化組織（紅色區(qū)域）顯著減少，肺部空氣量增加，表明功能恢復(fù)（圖3I，S3F）。然后對肺部進(jìn)行充分灌注后收集。整個肺部外觀圖像顯示，纖維化肺部因組織損傷導(dǎo)致間質(zhì)紅細(xì)胞滲漏，出現(xiàn)紅色病變，而健康組和CD5/βLNP治療組的肺部呈白色（圖3J）。

圖3. A.年輕或老年小鼠纖維化模型建立及治療策略示意圖。B，C.年輕小鼠體重變化(B)及存活曲線(C)。D. 肺部指數(shù)。E.第二次注射CD5/βLNP-FAPCAR 2.2后24小時脾肺T細(xì)胞中tdTomato報告基因表達(dá)情況。F. 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠CD3+肺T細(xì)胞的表達(dá)比值。G. 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺部FAP+Pdgfra+成纖維細(xì)胞比例。H. 術(shù)后第28天的數(shù)字照片。I. CT圖像和根據(jù)CT結(jié)果計算的肺部空氣量和 J. 肺組織照片

（3）老年小鼠的抗纖維化反應(yīng)

通過Masson和Picrosirius紅染色評估顯示，與生理鹽水、IgG/βLNP或PFD組相比，CD5/βLNP治療組的細(xì)胞外基質(zhì)纖維化顯著改善（圖4A–C）。此外，羥脯氨酸（HYP）測定顯示，經(jīng)CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，膠原蛋白含量接近健康水平（圖4D）。機(jī)械測試評估顯示，經(jīng)CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，全肺組織的彈性模量顯著降低（圖4E）?？傊⑸銫D5/βLNP-FAPCAR 2.2顯著減少了FAP陽性細(xì)胞數(shù)量，并拯救了肺纖維化，而PFD治療對纖維化的緩解效果有限，這可能是因?yàn)橹委煏r間較短。

特發(fā)性肺纖維化（IPF）的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，且在老年人群中更為普遍。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CD5/βLNP-FAPCAR 2.2在抑制肺纖維化中的作用，在16月齡的老年小鼠中建立了纖維化模型。與年輕小鼠相比，老年小鼠在接受相同劑量的博萊霉素后，博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為更大的區(qū)域?qū)嵶兠娣e、更高的Hounsfield單位（HU）密度以及更少的肺部空氣量（圖4I-K）。在接受CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，與博萊霉素+生理鹽水和IgG/βLNP組相比，老年小鼠的生存率顯著提高，肺系數(shù)降低，盡管老年小鼠的體重恢復(fù)速度不如年輕小鼠快（圖4F-H）。Masson染色和羥脯氨酸（HYP）定量顯示，在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，老年小鼠的纖維化和膠原蛋白含量顯著降低（圖4L，M）。這些結(jié)果表明，CD5/βLNP-FAPCAR 2.2療法可以抑制老年小鼠的肺纖維化。

圖4. A. Masson和Picrosirius紅染色顯示纖維化區(qū)域。B. 纖維化區(qū)域定量分析。 C. Ashcroft評分定量分析。D. 羥脯氨酸（HYP）測定用于定量膠原蛋白含量。E. 使用機(jī)械測試系統(tǒng)評估全肺組織的彈性模量。F. 老年小鼠體重變化。G. 老年小鼠存活率。H. 老年小鼠肺系數(shù)。I. 小鼠肺部照片。J，K. 微計算機(jī)斷層掃描（CT）圖像 。L. Masson染色定量分析纖維化區(qū)域。M. 羥脯氨酸（HYP）測定用于定量膠原蛋白含量

（4）纖維化肺中蛋白質(zhì)的特征

對博萊霉素給藥后0、14和28天的三個時間點(diǎn)進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析（每組4只小鼠），結(jié)果顯示BLM小鼠隨時間推移蛋白質(zhì)組發(fā)生了顯著變化（圖5A）。K-means聚類算法將所有組的4126個差異表達(dá)蛋白（DEPs）分為6個簇，這與熱圖結(jié)果一致。基于GOBP分析，簇被注釋為DNA修復(fù)、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組織、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和脂質(zhì)代謝過程（圖5B）。特別是，第3簇以ECM蛋白表達(dá)的持續(xù)增加為特征，這涉及到膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)的上調(diào)（例如，F(xiàn)n1、Fbln1、Col4a2、Col18a1）在BLM給藥后（圖5C，D）。對因CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療而恢復(fù)的肺與纖維化肺之間的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明（每組4只小鼠），PCA揭示了BLM+生理鹽水組和CD5/βLNP組之間DEPs的顯著差異（圖5E）。由CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療下調(diào)的頂級DEPs富集在ECM、炎癥和免疫調(diào)節(jié)中（圖5F），例如下調(diào)的ECM相關(guān)蛋白（Lox、Ctsd和Ctsz）和上調(diào)的抗炎蛋白（Prx、Hpdg和Ifitm3）。這些結(jié)果表明，通過使用CD5/βLNP-FAPCAR 2.2，促進(jìn)了抑制炎癥環(huán)境和ECM重塑過程。

圖5. A. 對纖維化組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)策略和PCA分析。B. 通過K-means算法獲得的蛋白質(zhì)簇，并在熱圖中顯示，其中4126個差異表達(dá)蛋白被富集到6個簇中?；贕OBP分析對簇進(jìn)行注釋。C. 點(diǎn)圖顯示了第3簇中富集的頂級10個GOBP術(shù)語。D. 顯示了博萊霉素給藥后0、14和28天的ECM相關(guān)蛋白。E. 對治療的BLM小鼠進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)策略和PCA分析。F. 點(diǎn)圖顯示了與圖（E）對應(yīng)的下調(diào)DEPs富集的頂級5個GOBP、GOCC和GOMF術(shù)語。G. 治療前后纖維化清除和ECM僵硬度調(diào)節(jié)的示意圖。H. 代表性免疫熒光圖像（紅色：KRT8；綠色：Sftpc；藍(lán)色：DAPI）。I. 點(diǎn)圖顯示了與圖（E）對應(yīng)的上調(diào)DEPs富集的GO術(shù)語。J. 上皮極化途徑的網(wǎng)絡(luò)投影圖。K. 代表性免疫熒光圖像顯示極化因子Cdc42和Pkcz（紅色：Cdc42；綠色：Pkcz；藍(lán)色：DAPI）在細(xì)胞中的位置。L. 代表性免疫熒光圖像顯示調(diào)節(jié)上皮極化的關(guān)鍵分子（藍(lán)色：DAPI；紅色：Calponin；綠色：Pkcz；白色：Cldn5）。M. 與血管生成（Vegfa、Eng）和二氧化碳調(diào)節(jié)（Ca4、Ca13）相關(guān)的蛋白質(zhì)相對豐度

（5）抗纖維化治療后肺泡上皮極化

蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的纖維化被清除。機(jī)械測試評估顯示，治療后肺組織的彈性模量顯著降低（圖4E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，細(xì)胞外組織張力降低（圖5G），有助于AT2向AT1的分化。此外，免疫熒光結(jié)果顯示，在治療后PATS的數(shù)量顯著減少（圖5H），表明AT2向AT1的分化已恢復(fù)正常。AT2向AT1細(xì)胞的分化與細(xì)胞形狀和結(jié)構(gòu)的顯著變化相關(guān)，通常被認(rèn)為是上皮極化過程。這種轉(zhuǎn)變通常伴隨著信號和結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的許多變化。在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，上調(diào)的DEPs主要富集在細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接信號通路中，所有這些都與細(xì)胞極化相關(guān)（圖5I），因此，根據(jù)KEGG分析繪制了極化分子圖（圖5J）。上皮細(xì)胞被認(rèn)為是肺恢復(fù)途徑富集的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，需要排除巨噬細(xì)胞極化或上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，因?yàn)檫@兩種過程可能在疾病進(jìn)展過程中發(fā)生。通過蛋白印跡分析了EMT標(biāo)記物的表達(dá)（圖6A）。從上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)低水平的E-鈣粘蛋白（一種粘附因子）和高水平的波形蛋白。這些標(biāo)記物的表達(dá)在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后接近正常水平。因此，治療抑制了EMT，并且沒有對極化信號富集做出貢獻(xiàn)。另一方面，在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，與巨噬細(xì)胞相關(guān)的富集基因在治療后減少（圖6B）。與基因表達(dá)的減少一致，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在炎癥性纖維化肺中，標(biāo)記為F4/80的巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，而在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后減少（圖6C）。亞型分析顯示，治療減少了被鑒定為促纖維化表型的M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量（圖6D，E）?？傮w而言，巨噬細(xì)胞總數(shù)和M2亞型的減少排除了CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后巨噬細(xì)胞極化對途徑富集的貢獻(xiàn)。

對于上皮細(xì)胞極化，由Cdc42和aPKC（Pkc-zeta）形成的信號軸被認(rèn)為是調(diào)節(jié)極化的關(guān)鍵。ECM信號通過Crb3感知并傳遞，Crb3招募Cdc42-aPKC-PAR6在頂膜區(qū)域形成復(fù)合體。這個復(fù)合體是將蛋白質(zhì)從頂膜區(qū)域排除的關(guān)鍵步驟，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，促進(jìn)蛋白質(zhì)在頂膜、側(cè)膜和基底膜之間的極化分布。為了驗(yàn)證這一機(jī)制，通過蛋白印跡檢測了Cdc42的表達(dá)水平。在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，肺組織中Cdc42的表達(dá)增加（圖6A）。此外，免疫熒光結(jié)果顯示，Cdc42和PKCz在細(xì)胞膜上共定位，并且這種共定位傾向于在細(xì)胞膜的一側(cè)而不是均勻分布在細(xì)胞膜上（圖6F，G）。細(xì)胞骨架相關(guān)的緊密連接得到增強(qiáng)（圖6H）。此外，血管生成標(biāo)記物（Eng，Vegfa）和二氧化碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ca4，Ca13）的上調(diào)（圖6I）表明，蛋白質(zhì)極化的增加驅(qū)動了受損結(jié)構(gòu)和功能的BLM肺在清除過度激活的成纖維細(xì)胞后通過FAPCAR 2.2 T細(xì)胞的自我修復(fù)。

圖6. A. 蛋白印跡圖像和EMT標(biāo)記基因以及Cdc42蛋白表達(dá)的定量。B. 巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的蛋白質(zhì)組學(xué)熱圖。C. 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示肺細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的百分比。D. 流式細(xì)胞術(shù)圖顯示M1/M2表型在BLM+生理鹽水和CD5/βLNP組之間的比較。E. 代表性免疫熒光圖像顯示肺組織中的巨噬細(xì)胞。（青色：F4/80；紅色：iNOS；綠色：CD163；白色：DAPI）。F，G. 代表性免疫熒光圖像顯示極化因子Cdc42和Pkcz（紅色：Cdc42；綠色：Pkcz；白色：DAPI）在細(xì)胞中的位置。H. 代表性免疫熒光圖像顯示調(diào)節(jié)上皮極化的關(guān)鍵分子。（藍(lán)色：DAPI；紅色：Calponin；綠色：Pkcz；白色：Cldn5）。I. 與血管生成（Vegfa，Eng）和二氧化碳調(diào)節(jié)（Ca4，Ca13）相關(guān)的蛋白質(zhì)相對豐度

（6）肺再生的細(xì)胞特征

蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，蛋白通路富集在細(xì)胞外基質(zhì)重塑和上皮極化中，暗示多種細(xì)胞類型可能參與信號調(diào)節(jié)。為了探索成功清除纖維化后的肺再生過程，通過10×Genomics平臺對BLM+生理鹽水和CD5/βLNP組的肺進(jìn)行了單細(xì)胞測序分析（圖7A）。通過建立的細(xì)胞標(biāo)記物對捕獲的細(xì)胞進(jìn)行無偏分類和鑒定，將47,129個細(xì)胞分為21個簇。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞屬于免疫系統(tǒng)，包括T細(xì)胞（CD3e+）、NK細(xì)胞（Nkg7+）、B細(xì)胞（CD79a+）和免疫單核細(xì)胞（Cst3+）。此外，還鑒定出幾個小群體為肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括肺泡細(xì)胞（Sftp+）、內(nèi)皮細(xì)胞（Pecam+）和成纖維細(xì)胞（Dcn+）（圖7B）。與BLM組相比，CD5/βLNP組中肺泡細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生了顯著變化，表明CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療調(diào)節(jié)了細(xì)胞特征（圖7C，D）。

成纖維細(xì)胞分為三個不同的簇，包括炎癥性、纖維化性和間皮細(xì)胞，這與最近的研究一致。簇0被鑒定為炎癥性成纖維細(xì)胞，其高表達(dá)Cxcl12和Cxcl13。纖維化性成纖維細(xì)胞以Fbln2和其他病理性的細(xì)胞外基質(zhì)基因特征。值得注意的是，兩個過表達(dá)Col1a1和Col3a1的簇在治療后顯著減少。此外，間皮性成纖維細(xì)胞以Msln為特征，在所有組中均保持不變（圖7E，F(xiàn)）。此外，F(xiàn)AP在纖維化性和炎癥性簇中均有表達(dá)。這兩個簇中的大多數(shù)細(xì)胞在BLM組中被發(fā)現(xiàn)，表明FAPCAR-T細(xì)胞有效地清除了目標(biāo)細(xì)胞，而沒有影響其他細(xì)胞群。

肺泡細(xì)胞是肺再生的關(guān)鍵因素（圖7H）。AT1細(xì)胞被分為兩個簇，即“AT1”，其Ager表達(dá)水平較高，以及“Hopxhigh AT1”，其Hopx表達(dá)特異性較高。Hopx參與早期發(fā)育和分化途徑。就這個簇中的Krt8表達(dá)而言，Hopxhigh AT1被認(rèn)為是一種中間狀態(tài)。此外，簇2被鑒定為PATS，其高表達(dá)Krt8和Sftpc。Cxcl2+細(xì)胞群的特征是高表達(dá)與炎癥、纖維化和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因。這個簇在治療后幾乎消失，表明這些細(xì)胞可能是高度炎癥性損傷細(xì)胞，這些細(xì)胞在肺纖維化發(fā)展過程中暫時出現(xiàn)（圖7I-K）。上述所有被鑒定為中間狀態(tài)或與炎癥相關(guān)的簇在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后減少，與蛋白質(zhì)組學(xué)分析一致（圖7I）。重要的是，在整個肺細(xì)胞的UMAP中鑒定出簇12為增殖性肺泡祖細(xì)胞（PAPCs）（圖7B），這是一個與肺泡細(xì)胞相關(guān)的顯著增加的簇。這一群體以Pclaf、Mki67和Top2a的特異性表達(dá)為特征（圖7L）。先前的研究強(qiáng)調(diào)，PAPCs在肺泡細(xì)胞系可塑性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作為祖細(xì)胞庫，并且對于肺再生是必不可少的。為了驗(yàn)證PAPCs的功能，重新聚類PAPCs與肺泡細(xì)胞（圖7M），并使用RNA速度和Slingshot進(jìn)行細(xì)胞系軌跡推斷。PAPCs的發(fā)育軌跡被發(fā)現(xiàn)朝向肺泡細(xì)胞（圖7N）。此外，AT1細(xì)胞是AT2、Hopxhigh AT1和PATS簇分化的終點(diǎn)。這些結(jié)果表明，在肺恢復(fù)過程中，肺泡細(xì)胞系可塑性增加，AT2或PAPCs在分化為AT1細(xì)胞中發(fā)揮了積極作用。

圖7.A.小鼠肺單細(xì)胞測序研究設(shè)計。B. 細(xì)胞簇的UMAP圖和對部分捕獲的肺細(xì)胞的注釋。C. 比較BLM+生理鹽水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2組的簇成分。D. 顯示顯著變化的簇的樣本分布。E. 成纖維細(xì)胞簇的UMAP嵌入。F. 比較BLM+生理鹽水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2組的成纖維細(xì)胞細(xì)胞簇。G. 在UMAP上表達(dá)纖維化和過度激活的成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)投影。H，I. 肺泡細(xì)胞的UMAP圖和注釋（H）以及比較BLM+生理鹽水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2組的簇狀態(tài)（I）。J. 每個肺泡細(xì)胞簇的代表性標(biāo)記物的點(diǎn)圖。K. 在整個肺細(xì)胞簇上表達(dá)特定肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)投影。L， M. PAPCs標(biāo)記基因在整個肺細(xì)胞簇中的表達(dá)（L）以及在與肺泡細(xì)胞重新聚類的UMAP圖中突出顯示PAPCs標(biāo)記基因（M）。PAPCs：增殖性肺泡祖細(xì)胞。N. RNA速度分析包括肺泡細(xì)胞和PAPCs的簇

（7）Apoe+巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞類型對肺免疫重建至關(guān)重要

除了結(jié)構(gòu)恢復(fù)外，免疫重建也是器官再生的重要步驟。分析了巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。首先，巨噬細(xì)胞被分為10個簇，其中4個簇（簇2、4、5、7）在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后顯著減少，而3個簇（簇0、3、8）增加。簇0、1、2、4、5和6富含肺泡巨噬細(xì)胞（AM）標(biāo)記物（Ear1、Ear2、Chil3、Plet1）（圖8A-C）。其余簇為單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（mono-M），表達(dá)Ccr5、CD33、Sell和Itgam。簇2、4和5被鑒定為促纖維化的脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞（LAMs），因?yàn)樗鼈兏弑磉_(dá)促纖維化基因（Fn1、Spp1、CD44）和脂質(zhì)代謝基因（Lpl、Trem2、Fabp4、Fabp5）。簇7和9表達(dá)炎癥基因（Il1b、S100a9、S100a8）和典型的骨髓標(biāo)記基因（CD33），表明它們的單核細(xì)胞譜系（圖8C）。簇7也參與促纖維化過程。減少的巨噬細(xì)胞（簇2、4、5、7）表明，F(xiàn)APCAR-T細(xì)胞通過清除過度激活的成纖維細(xì)胞，打破了炎癥-纖維化循環(huán)，這與流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。

由于ApoE是一種分泌蛋白，評估了細(xì)胞間通訊。CellphoneDB分析顯示肺泡巨噬細(xì)胞與ApoE+巨噬細(xì)胞之間存在強(qiáng)烈的相互作用（圖8D）。Trem2已被報道為觸發(fā)髓系細(xì)胞分化和發(fā)育的受體。蛋白質(zhì)相互作用分析顯示，ApoE和Trem2配體對僅出現(xiàn)在簇1/3組中（圖8E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ApoE+巨噬細(xì)胞可能有助于刺激髓系細(xì)胞的分化和發(fā)育。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一發(fā)現(xiàn)，偽時間分析顯示，表達(dá)高單核細(xì)胞標(biāo)記物的簇作為根細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過中間簇3分化為產(chǎn)生成熟的先天免疫細(xì)胞或成熟的肺泡巨噬細(xì)胞（圖8F）。相應(yīng)地，RNA速度分析顯示了從ApoE+單核細(xì)胞到AM簇的發(fā)展路徑（圖8G）?？傮w而言，與纖維化相關(guān)的肺泡巨噬細(xì)胞在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后顯著減少，而ApoE+單核細(xì)胞群體參與了肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量的定量補(bǔ)充，以維持其表型用于免疫重建。

對于T細(xì)胞，簇7-9被鑒定為成熟的效應(yīng)細(xì)胞群體（Tc1和Th1）和CD4+記憶T細(xì)胞（Tm），通過標(biāo)記基因進(jìn)行注釋。重新聚類顯示，在CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療后，這3個簇的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。幼稚T細(xì)胞（Tn，簇0、1、6）被鑒定為Lef1、Ccr7和Sell的特征，并且在BLM組中更為豐富（圖8H-J）。KEGG富集顯示，Tn細(xì)胞富含Jak-Stat通路和干細(xì)胞分化，而效應(yīng)細(xì)胞群體富含Rap1信號通路、細(xì)胞因子釋放通路和TCR激活通路（圖8K）?；趥螘r間、Slingshot和RNA速度，Tn細(xì)胞可以被分類為干細(xì)胞。這些分析進(jìn)一步揭示了Tn細(xì)胞的不同發(fā)育軌跡：分化為高表達(dá)Ifng和Gzma的群體，或分化為Th17和γδ T細(xì)胞（圖8L-N）。此外，Ly6a（TCR依賴性激活的標(biāo)記）在Th1細(xì)胞中高表達(dá)。這些結(jié)果表明，由于CD5/βLNP-FAPCAR 2.2治療在纖維化肺中招募了瞬時FAPCAR-T細(xì)胞，導(dǎo)致大量效應(yīng)細(xì)胞在肺組織中積累。值得注意的是，這種治療導(dǎo)致了記憶T細(xì)胞新簇的出現(xiàn)，而在BLM組中完全缺失（圖8I）。

圖8. A. 重新聚類的巨噬細(xì)胞簇的UMAP圖。B. 不同簇中的細(xì)胞百分比。 C. 肺泡、纖維化和脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因的突出顯示。 D. 使用CellphoneDB分析巨噬細(xì)胞簇對之間的相互作用。 E. 簇1/3通訊中顯著變化的配體-受體對。P值由Bimod測試確定。 F，G. 偽時間（F）和RNA速度（G）分析ApoE+單核細(xì)胞的發(fā)育速率。 H，I. 重新聚類的T細(xì)胞簇的UMAP圖：簇注釋（H）和兩組（BLM+生理鹽水與BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2）之間的比較（I）。J. 比較BLM+生理鹽水和BLM+CD5/βLNP-FAPCAR 2.2組的T細(xì)胞簇。K. T細(xì)胞簇的KEGG富集分析。L，M. 偽時間（L）和Slingshot（M）分析Tn細(xì)胞的分化軌跡。N. T細(xì)胞簇中誘導(dǎo)型T細(xì)胞共刺激因子（Icos）和白細(xì)胞介素-17a（Il17a）的表達(dá)水平，隨著發(fā)育軌跡的增加而增加。（AM：肺泡巨噬細(xì)胞；Mono-M：單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞；Tn：幼稚T細(xì)胞；DNT：雙陰性T細(xì)胞；Tm：記憶T細(xì)胞；Tc：細(xì)胞毒性T細(xì)胞；Th：輔助T細(xì)胞；Treg：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）