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針對(duì)上述問(wèn)題，蘭州大學(xué)李汛教授、姚佳研究員團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種可腹腔注射的金屬多酚水凝膠（CMC-OD-TA-Fe(III)）緩釋體系：先將高親和力配體AEAA修飾于hucMSC-Exo表面，賦予其特異性識(shí)別并內(nèi)化活化HSC的能力；再將該靶向外泌體包載于羧甲基殼聚糖/氧化葡聚糖-單寧酸-Fe3?三維網(wǎng)絡(luò)凝膠中。凝膠經(jīng)腸系膜動(dòng)脈-門靜脈途徑高效入肝，持續(xù)釋放外泌體，實(shí)現(xiàn)“長(zhǎng)循環(huán)-靶向蓄積-抗纖維化”一體化治療，為臨床提供安全、經(jīng)濟(jì)、高效的新策略。該文章于2025年9月26日以《Hydrogel Loaded with Aminoethyl Anisamide-Modified Exosomes Attenuates Hepatic Fibrosis by Targeting Activated Hepatic Stellate Cells》為題發(fā)表于《ACS NANO》（DOI：10.1021/acsnano.5c06003）。

研究示意圖

(1) 水凝膠和外泌體的合成與表征

本研究證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有治療潛力。外泌體表征結(jié)果顯示：掃描電鏡顯示典型囊泡結(jié)構(gòu)（圖1A），納米顆粒追蹤分析表明粒徑集中分布于135 nm（圖1B），Western blot檢測(cè)到TSG101、CD81、CD9等表面標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)（圖1C）。水凝膠系統(tǒng)表征表明：CMC-OD/TA-Fe及載外泌體水凝膠均呈現(xiàn)均勻多孔結(jié)構(gòu)，孔徑較CMC-OD凝膠更小且分布均勻（圖1D）。高倍電鏡可見(jiàn)外泌體附著于凝膠表面（圖1E），元素能譜檢測(cè)到C、N、O、P、Fe等特征元素（圖1F），證實(shí)AEAA-外泌體成功負(fù)載。

圖1.（A）采用透射電子顯微鏡表征外泌體超微結(jié)構(gòu)。（B）通過(guò)納米顆粒追蹤分析技術(shù)檢測(cè)外泌體粒徑分布。（C）采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物（TSG101、CD9、CD89）。（D）冷凍干燥后不同水凝膠的SEM微觀形貌。（E）CMC-OD/TA-Fe/AEAA-Exos水凝膠的SEM微觀結(jié)構(gòu)及表面附著外泌體的高倍形貌。（F）CMC-OD/TA-Fe/AEAA-Exos水凝膠的元素能譜分析

（2）水凝膠的合成與性能表征

本研究測(cè)得OD氧化度為40%，傅里葉變換紅外光譜顯示氧化葡聚糖在1731.8 cm^?1處出現(xiàn)醛基特征吸收峰（圖2A），¹H NMR譜圖在4.2?5.8 ppm化學(xué)位移區(qū)間出現(xiàn)半縮醛結(jié)構(gòu)特征峰（圖2B），證實(shí)葡聚糖成功氧化。CMC-OD水凝膠在1608.9 cm^?1處出現(xiàn)亞胺鍵特征峰（圖2A），表明成功通過(guò)席夫堿反應(yīng)形成凝膠。CMC-OD/TA-Fe水凝膠呈紅褐色（圖2D），凝膠時(shí)間短于CMC-OD凝膠。注射性測(cè)試表明該水凝膠可通過(guò)注射器順暢推注并保持形態(tài)穩(wěn)定（圖2E）。自愈合實(shí)驗(yàn)顯示切斷的水凝膠30分鐘內(nèi)可重新愈合（圖2F），指關(guān)節(jié)彎曲實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的粘彈性（圖2G）。豬皮實(shí)驗(yàn)表明CMC-OD/TA-Fe凝膠在生理鹽水中浸泡24小時(shí)后仍保持完整粘附（圖2H）。降解實(shí)驗(yàn)顯示CMC-OD/TA-Fe水凝膠14天后降解速率趨于穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)于CMC-OD凝膠（圖2I）。溶脹實(shí)驗(yàn)表明CMC-OD/TA-Fe水凝膠達(dá)到溶脹平衡時(shí)間稍長(zhǎng)，最大溶脹度較低（圖2J）。流變學(xué)測(cè)試顯示水凝膠儲(chǔ)能模量為1000 Pa，臨界應(yīng)變?yōu)?13%（圖2K），階躍應(yīng)變實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具備完整的結(jié)構(gòu)自恢復(fù)能力。

圖2.（A）水凝膠組分的傅里葉變換紅外光譜分析。（B）葡聚糖及氧化葡聚糖的1H NMR檢測(cè)。（C，D）分別為CMC-OD與CMC-OD/TA-Fe水凝膠的膠體狀態(tài)展示。（E）CMC-OD/TA-Fe水凝膠的注射性能測(cè)試。（F）CMC-OD/TA-Fe水凝膠的自愈合性能測(cè)試。（G）CMC-OD/TA-Fe水凝膠的粘彈性測(cè)試。（H）通過(guò)豬皮實(shí)驗(yàn)評(píng)估CMC-OD與CMC-OD/TA-Fe水凝膠的粘附性能。（I）水凝膠降解特性分析。（J）水凝膠溶脹性能分析。（K）分別通過(guò)角頻率測(cè)試、應(yīng)力測(cè)試與階躍應(yīng)變測(cè)試評(píng)估CMC-OD/TA-Fe水凝膠的流變學(xué)特性

（3）水凝膠和外泌體系統(tǒng)體外生物安全性評(píng)估

通過(guò)體外生物相容性實(shí)驗(yàn)評(píng)估水凝膠系統(tǒng)的生物安全性。活死染色顯示L929細(xì)胞在不同組別水凝膠提取物中培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)與存活率均無(wú)顯著變化（圖3A、C）。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)表明L929與BRL-3A細(xì)胞在CMC-OD、Gel及Gel/AEAA-Exos水凝膠表面均生長(zhǎng)良好（圖3B），培養(yǎng)24小時(shí)后熒光強(qiáng)度定量分析顯示各組間細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異（圖3D）。

CCK-8檢測(cè)顯示：經(jīng)不同濃度（10%-100%）Gel/AEAA-Exos水凝膠提取物培養(yǎng)1/3/5天后，L929與BRL-3A細(xì)胞活力分別維持在91.7%以上（圖3E）和84.3%以上（圖3F）。100%濃度不同組別水凝膠提取物培養(yǎng)1/3天后，L929細(xì)胞活力均高于91.8%（圖3G），符合ISO 10993-5標(biāo)準(zhǔn)中0級(jí)細(xì)胞毒性要求。溶血實(shí)驗(yàn)顯示Gel與Gel/AEAA-Exos組溶液呈無(wú)色透明狀，溶血率低于5%（圖3H）。凝血功能檢測(cè)表明Gel/AEAA-Exos組的PT、APTT、TT及FIB指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異（圖3I-J）。

圖3.（A）經(jīng)不同組別水凝膠提取物處理的L929細(xì)胞活死染色結(jié)果。（B）在不同水凝膠表面培養(yǎng)的L929細(xì)胞與BRL-3A細(xì)胞黏附測(cè)試。（C）基于ImageJ軟件對(duì)（A）圖中L929細(xì)胞活細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的定量分析。（D）基于ImageJ軟件對(duì)（B）圖中L929與BRL-3A細(xì)胞活細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的定量分析。（E）水凝膠對(duì)L929細(xì)胞的CCK-8毒性檢測(cè)。（F）水凝膠對(duì)BRL-3A細(xì)胞的CCK-8毒性檢測(cè)。（G）通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同水凝膠對(duì)BRL-3A細(xì)胞的毒性效應(yīng)。（H）水凝膠溶血效應(yīng)評(píng)估。（I，J）水凝膠凝血功能評(píng)估

（4）水凝膠和外泌體系統(tǒng)體外生物學(xué)功能評(píng)價(jià)

為增強(qiáng)外泌體靶向治療效果，采用AEAA對(duì)hucMSCs來(lái)源外泌體進(jìn)行工程化修飾。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示，AEAA修飾外泌體（AEAA-Exos組）在活化肝星狀細(xì)胞核周呈現(xiàn)顯著富集的紅色熒光信號(hào)（圖4A），定量分析證實(shí)其對(duì)活化肝星狀細(xì)胞具有特異性靶向能力（圖4E）。DCFH-DA探針檢測(cè)顯示，AEAA-Exos組能顯著降低活化肝星狀細(xì)胞內(nèi)ROS水平，熒光定量分析（圖4F）證實(shí)其抗ROS效果優(yōu)于未修飾外泌體組（圖4B）。纖維化指標(biāo)檢測(cè)表明，AEAA-Exos可有效抑制活化肝星狀細(xì)胞中α-SMA（圖4C、G）和Colla I（圖4D、H）的表達(dá)，RT-PCR分析進(jìn)一步顯示其能顯著降低α-SMA和Col1a1的mRNA表達(dá)水平。

圖4.（A）凝膠/AEAA-Exos系統(tǒng)對(duì)活化肝星狀細(xì)胞的靶向性評(píng)估。（B）凝膠/AEAA-Exos系統(tǒng)的抗ROS能力評(píng)價(jià)。（C）通過(guò)α-SMA指標(biāo)評(píng)估系統(tǒng)的抗纖維化效果。（D）通過(guò)Colla I指標(biāo)評(píng)估系統(tǒng)的抗纖維化效果。（E）外泌體陽(yáng)性區(qū)域、（F）DCFH陽(yáng)性區(qū)域、（G）α-SMA陽(yáng)性區(qū)域及（H）Colla I陽(yáng)性區(qū)域的定量分析

（5）水凝膠和外泌體系統(tǒng)體內(nèi)靶向能力評(píng)估

通過(guò)SD大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估凝膠/AEAA-Exos遞送系統(tǒng)的靶向能力。小動(dòng)物活體成像顯示：水凝膠組在植入后12小時(shí)至7天內(nèi)外泌體信號(hào)持續(xù)增強(qiáng)（圖5A），而游離AEAA-外泌體組在第1天即顯著減少，第7天基本消失（圖5A、D、E）。器官分布檢測(cè)表明Gel/AEAA-Exos組外泌體在肝臟中富集最顯著，脾、腎、心、肺中分布較少（圖5B、D）。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示59.3%的外泌體在前7天釋放，與體內(nèi)7天達(dá)到積累峰值的結(jié)果相符（圖5B）。組織免疫熒光分析顯示，Gel/AEAA-Exos組在α-SMA標(biāo)記的活化肝星狀細(xì)胞周圍呈現(xiàn)大量紅色外泌體信號(hào)聚集（圖5C），定量分析證實(shí)其外泌體定位效率顯著高于未修飾組（圖5F）。

圖5. （A）不同處理組SD大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的小動(dòng)物活體成像；（B）外泌體在肝臟分布的時(shí)相評(píng)估；（C）外泌體靶向活化肝星狀細(xì)胞的免疫熒光分析；（D）體外外泌體分布熒光定量；（E）肝臟外泌體分布熒光定量；（F）外泌體肝內(nèi)分布定量分析

（6）水凝膠和外泌體系統(tǒng)體內(nèi)生物安全性評(píng)價(jià)

通過(guò)30天體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估水凝膠/外泌體遞送系統(tǒng)的生物安全性。降解實(shí)驗(yàn)顯示水凝膠在30天內(nèi)未完全降解，證實(shí)其具備持續(xù)釋放的物理基礎(chǔ)。大鼠整體狀態(tài)良好，胃腸道系統(tǒng)通暢無(wú)粘連。組織病理學(xué)分析表明，Gel/AEAA-Exos組肝臟結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，脾、腎、肺、心臟（圖6A）及腦組織的實(shí)質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均與正常組無(wú)顯著差異。血清學(xué)檢測(cè)顯示Gel/AEAA-Exos組的ALT、AST、CREA、UREA指標(biāo)（圖6B-E）以及TNF-α和IL-4炎癥因子水平（圖6F-G）與正常組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）。

圖6.（A）小鼠植入Gel/AEAA-Exos 7天后正常組與實(shí)驗(yàn)組肝臟、脾臟、腎臟、心臟和肺的HE染色圖（標(biāo)尺：400 μm）。（B-E）分別通過(guò)血清ALT、AST、CREA和UREA水平評(píng)價(jià)Gel/AEAA-Exos系統(tǒng)的生物安全性。（F，G）分別通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)血清TNF-α和IL-4水平評(píng)價(jià)Gel/AEAA-Exos系統(tǒng)的生物安全性

（7）水凝膠和外泌體系統(tǒng)體內(nèi)抗纖維化能力評(píng)估

采用C57BL/6J小鼠建立肝纖維化模型（圖7A）。肝臟大體觀察顯示Model組和Gel組出現(xiàn)明顯纖維化瘢痕，而Gel/AEAA-Exos組與Gel/Exos組無(wú)顯著差異。HE染色表明Gel/AEAA-Exos組的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著少于Model組、Gel組及Gel/Exos組（圖7B、8D）。Masson染色顯示Model組和Gel組形成明顯膠原纖維環(huán)狀結(jié)構(gòu)，Gel/AEAA-Exos組的纖維化面積顯著小于其他各組（圖7E）。天狼星紅染色結(jié)果與Masson染色趨勢(shì)一致。RT-PCR分析證實(shí)Gel/AEAA-Exos能顯著降低α-SMA、Col1a1和Col3a1的基因表達(dá)水平（P < 0.01）。免疫組化檢測(cè)顯示：Gel/AEAA-Exos組PColla III表達(dá)顯著低于Model組、Gel組及Gel/Exos組（圖7B、8F）。MMP9在Gel/AEAA-Exos組中分布最多（圖7C），定量分析證實(shí)其表達(dá)量顯著高于Model組（圖7G）。

圖7.（A）肝纖維化造模及抗纖維化治療流程示意圖。（B）通過(guò)HE染色、Masson染色、天狼星紅染色和PColla III染色評(píng)估凝膠/AEAA-Exos系統(tǒng)的抗纖維化效果。（C）通過(guò)MMP9指標(biāo)評(píng)估凝膠/AEAA-Exos系統(tǒng)的抗纖維化效果。（D）炎癥陽(yáng)性區(qū)域、（E）Masson陽(yáng)性區(qū)域、（F）PColla III陽(yáng)性區(qū)域及（G）MMP9陽(yáng)性區(qū)域的定量分析

（8）水凝膠和外泌體系統(tǒng)體內(nèi)抗肝纖維化效果的免疫熒光與血清學(xué)評(píng)估

通過(guò)血清學(xué)分析評(píng)估肝纖維化改善程度。Model組和Gel組的ALT和AST水平較Normal組顯著升高（圖8E）。與Model組相比，Gel/Exos和Gel/AEAA-Exos治療組的ALT/AST水平明顯降低，其中Gel/AEAA-Exos組的ALT水平顯著低于Gel/Exos組，但兩組間AST水平無(wú)顯著差異（圖8E）。細(xì)胞因子檢測(cè)顯示，Gel/Exos和Gel/AEAA-Exos組的TNF-α表達(dá)均低于Model組，而IL-4水平升高，兩組治療組間的細(xì)胞因子譜無(wú)顯著差異（圖8F）。

圖8.（A、B）分別通過(guò)TGF-β與α-SMA評(píng)估凝膠/AEAA-Exos系統(tǒng)的抗纖維化效果。（C）TGF-β陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域與α-SMA陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的定量分析。（D）通過(guò)Elisa檢測(cè)評(píng)估的氧化應(yīng)激水平（SOD與MDA）。（E）通過(guò)Elisa檢測(cè)評(píng)估的血清ALT與AST水平。（F）通過(guò)Elisa檢測(cè)評(píng)估的炎癥水平（TNF-α與IL-4）

（9）通過(guò)轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序分析Gel/AEAA-Exos的抗纖維化機(jī)制

差異基因分析顯示治療組與疾病模型共鑒定1398個(gè)差異表達(dá)基因，其中28個(gè)為共有基因（圖9A）。模型組與對(duì)照組相比存在152個(gè)上調(diào)基因和58個(gè)下調(diào)基因（圖9B），而Gel/AEAA-Exos治療組與模型組相比顯示1355個(gè)基因上調(diào)和443個(gè)基因下調(diào)（圖9C）。

KEGG通路分析表明模型組差異基因主要富集于MAPK、PPAR、TGF-β等氧化應(yīng)激相關(guān)通路（圖9D），Gel/AEAA-Exos組則顯著富集于MAPK通路、NF-κB信號(hào)、細(xì)胞因子受體相互作用等通路（圖9E）。熱圖分析顯示MAPK通路在肝纖維化發(fā)生與逆轉(zhuǎn)過(guò)程中均呈現(xiàn)顯著表達(dá)（圖9F）。RT-PCR驗(yàn)證證實(shí)治療組中MAP3K13、ASK1、MAPK14、MAPK1、HSPB1表達(dá)顯著下調(diào)，MMP9表達(dá)顯著上調(diào)（圖9G），促纖維化基因（α-SMA、Col1a1、Col3a1）表達(dá)同步下調(diào)。

圖9.（A）不同組別差異基因韋恩圖。（B、C）模型組與Gel/AEAA-Exos組的差異基因火山圖。（D、E）模型組和Gel/AEAA-Exos組差異基因相關(guān)通路的KEGG散點(diǎn)圖分析。（F）抗纖維化通路相關(guān)基因的熱圖分析。（G）通過(guò)RT-PCR檢測(cè)MAP3K13、ASK1、MAPK14、MAPK1、HSPB1和MMP9的基因表達(dá)水平