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針對上述問題，重慶大學羅忠/胡燕教授團隊提出了一種活體微生態(tài)微針貼片（LMMP），它能夠緩解感染性糖尿病傷口（IDW）部位的缺氧問題，同時減輕過度炎癥和微生物感染。通過席夫堿反應(yīng)將改性的羧甲基殼聚糖（CMC）與氧化透明質(zhì)酸（OHA）交聯(lián)，生成柔性片狀水凝膠基質(zhì)；隨后通過聚合物澆鑄，使小球藻（Chl）整合的微針通過甲基丙烯酸酐改性透明質(zhì)酸（HAMA）-Chl混合物的光交聯(lián)作用形成在水凝膠貼片上，實現(xiàn)了小球藻的穩(wěn)定錨定。LMMP能夠無痛地刺穿表層并穩(wěn)定附著在傷口組織上，通過基于光合作用的局部氧合作用，同時抑制慢性炎癥和微生物感染，以微創(chuàng)的方式促進傷口的微環(huán)境重塑，從而顯著加速IDW的愈合。該文章于2025年6月3日以《Living Microecological Microneedle Patches Enable Proregenerative Microenvironmental Remodeling for Promoting Infected Diabetic Wound Healing》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c05381）。

圖1. LMMP的合成過程及感染性糖尿病傷口（IDW）治療機制示意圖

（1）LMMP 的制備與表征

LMMP系統(tǒng)由OHA-CMC水凝膠基底與HAMA微針陣列構(gòu)成：CMC-GA經(jīng)PBA介導的硼酸酯接枝后與OHA席夫堿交聯(lián)形成基底；甲基丙烯酸改性透明質(zhì)酸（HAMA）經(jīng)紫外光固化在棱錐模具內(nèi)成型為微針陣列，錨定于基底并物理包封小球藻。FT-IR確認HAMA、OHA、CMC-GA合成完成（圖2A、B）。SEM顯示微針呈四棱錐形，基底邊長320 μm、高640 μm，針內(nèi)顆粒平均8 μm，證實小球藻整合（圖2D）。流變學測試顯示0.1–10 rad/s內(nèi)G'＞G''，表明基底具備類凝膠機械穩(wěn)定性（圖2C）。GAMP在去離子水及PBS中4 h溶脹率≈200%，含水率≈70%；30 °C開放環(huán)境4 h脫水率≈30%，LMMP與GAMP無顯著差異（圖2E、F）。力-位移曲線表明60%壓縮下，LMMP與GAMP針尖力分別為0.34 N與0.32 N，可完整穿透小鼠皮膚，移除后腔道5 min內(nèi)消失（圖2G、H）。在含16.7 mM葡萄糖+200 μM H?O?的模擬IDW液中，LMMP 10 h GA釋放量較PBS提高200%，證實硼酸酯連接的IDW響應(yīng)釋放（圖2I）。

（2）LMMP 介導的產(chǎn)氧能力評估

小球藻濃度5×10?個/mL光照后溶液氧水平達6.3 mg/L，5×10?個/mL時為4.2 mg/L，故LMMP采用5×10?個/mL濃度（圖2J）。L929和HUVEC與小球藻共孵育后細胞活力無變化（圖2K）。LMMP與等量小球藻產(chǎn)氧量無顯著差異，表明整合過程不影響光合活性（圖2L）。LMMP在仿生緩沖液中持續(xù)光照，前4天氧濃度≈6 mg/L，隨后降至≈5 mg/L（圖2M）。

圖2. LMMP 的制備與表征。（A）OHA和HAMA的傅里葉變換紅外光譜。（B）CMC-PBA的傅里葉變換紅外光譜。（C）GAMP和LMMP在37°C下的儲能模量（G'）和損耗模量（G''）。（D）LMMP的掃描電子顯微鏡圖像。（E）LMMP在水和PBS中孵育后的溶脹率。（F）GAMP和LMMP在30°C下的脫水率。（G）GAMP和LMMP的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線。（H）LMMP在小鼠皮膚上的處理效果及移除后皮膚恢復的圖像分析。（I）在模擬IDW條件下LMMP中GA的釋放曲線。（J）氧合測量過程的示意圖。（K）不同濃度Chl孵育后L929細胞的存活率變化。（L）光刺激下LMMP介導的氧氣生成。（M）不同樣品產(chǎn)氧能力的時間依賴性變化

（3）LMMPs 的體外抗菌能力評估

MP對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、MRSA、白色念珠菌的抑制率分別為46%、47%、48%、47%；GAMP因GA的加入抑制率均顯著升高；小球藻單獨作用產(chǎn)生輕微抑制。LMMP在上述四種病原體中的存活率分別降至7%、6%、7%、5%，CLSM活/死染色與顯微圖像證實其細胞壁破裂、胞質(zhì)外泄（圖3A–G）。結(jié)晶紫定量顯示，在生物膜條件下，LMMP+光照對四種病原體的存活率分別為10%、9%、8%、8%（圖3H–L）。

圖3. LMMPs的體外抗菌能力。（A）經(jīng)MP和LMMP處理4小時后，大腸桿菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的存活率。（B-E）不同處理后大腸桿菌（B）、銅綠假單胞菌（C）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（D）和白色念珠菌（E）的相對微生物存活率。（F）經(jīng)LMMP處理后，通過碘化丙啶（紅色）和SYTO 9（綠色）染色得到的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的共聚焦圖像。（G）不同處理后微生物形態(tài)的掃描電子顯微鏡圖像。（H）不同處理組生物膜的結(jié)晶紫染色圖像。（I-L）生物膜中微生物病原體存活情況的定量分析

（4）LMMP 的體外生物相容性分析

LMMP與L929及HUVEC共孵育6 h后，CCK-8測得細胞活力均＞100%，CLSM活/死染色未見細胞死亡（圖4B、C、E）。與血細胞共孵育溶血率≈3%（圖4D）。

（5）LMMP 的體外微生態(tài)復氧作用

低氧（1% O?）下，PBS、MP、GAMP組RDPP熒光持續(xù)；ChlMP與LMMP光照6 h后熒光消失，顯示小球藻光合供氧（圖4F、G）。LMMP光照8 h后HUVEC管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量最多、分支豐富且總長最長（圖5A、B）；劃痕與Transwell實驗顯示48 h后HUVEC和L929遷移面積最小、侵襲細胞最多（圖5C–H）。WB證實LMMP光照顯著上調(diào)HUVEC中PI3K-AKT及MAPK-ERK磷酸化（圖5I–L）。黑暗條件下未見上述效應(yīng)，排除單純光照影響。

圖4. LMMP的體外生物相容性及促愈合能力評估。（A）共培養(yǎng)模型示意圖。（B）不同處理后 L929 細胞的活力。（C）不同處理后HUVECs的活力。（D）不同樣品的溶血活性。（E）LMMP與L929細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞相容性。（F）不同處理下缺氧L929細胞中的氧豐度。（G）不同處理下缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的氧豐度。（H）不同處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)的光學成像

圖5. LMMP在體外對內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的調(diào)控作用及潛在分子機制研究。（A、B）不同處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）分支點數(shù)量（A）和管長（B）的定量分析。（C）不同處理后HUEVC遷移能力的定量分析。（D）不同處理后L929細胞遷移能力的定量分析。（E）不同處理后HUEVC遷移的光學圖像。（F）不同處理后L929細胞遷移的光學圖像。（G）不同處理后HUEVC的Transwell侵襲實驗結(jié)果。（H）不同處理后L929細胞的Transwell侵襲實驗結(jié)果。（I）不同處理（有光照）后HUEVC中p-PI3K/p-AKT激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（J）不同處理（無光照）后HUEVC中p-PI3K/p-AKT激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（K）不同處理（有光照）后HUEVC中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（L）不同處理（無光照）后HUEVC中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（M）不同處理（有光照）后L929細胞中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（N）不同處理（無光照）后L929細胞中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析

（5）LMMP 介導的體外抗炎效果評估

LPS誘導RAW264.7呈M1表型（iNOS?/CD206?）（圖6A）。MP無顯著影響；無GA的LMMP使M2比例輕度上升（圖6B、C）。LMMP組M1/M2比值降至1.27（圖6D），Nrf2與HO-1表達較PBS升高200%（圖6E）。LMMP+光照下，TNF-α與IL-1β分別下降70%與75%，IL-4與IL-10分別升高300%與230%；ELISA與qPCR結(jié)果一致（圖6F–M）。

圖6. LMMP的體外免疫調(diào)節(jié)效果評估。（A）RAW264.7細胞中CD206（綠色）和iNOS（紅色）表達的熒光顯微鏡圖像。（B、C）iNOS（B）和CD206（C）相對熒光強度的定量分析。（D）不同處理后M1和M2型巨噬細胞極化狀態(tài)頻率的流式細胞術(shù)分析。（E）不同處理后RAW264.7細胞中Nrf2和HO-1激活狀態(tài)的WB分析。（F-I）RAW264.7細胞經(jīng)不同處理后，TNF-α（F）、IL-1β（G）、IL-4（H）和IL-10（I）水平的ELISA結(jié)果。（J-M）RAW264.7細胞經(jīng)不同處理后，TNF-α（J）、IL-1β（K）、IL-4（L）和IL-10（M）mRNA表達水平的qPCR分析

（6）LMMP 介導的IDW體內(nèi)治療效果評估

MRSA感染糖尿病小鼠模型中，9天后Con-、Con+相對傷口面積≈13%、45%，LMMP+光照組傷口基本閉合（圖7B、C）。LMMP+光照4天出現(xiàn)密集肉芽組織與部分表皮修復，9天組織完全愈合，膠原沉積量最高（圖7G）。LMMP+光照組K14連續(xù)基底細胞層與成熟K10棘層覆蓋傷口；CD31熒光115.29%，高于Con+86.87%，并上調(diào)VEGFA、激活PI3K-AKT、MAPK-ERK通路（圖8A–E，7D–E）。Nrf2-HO-1激活，iNOS下調(diào)90%、CD206上調(diào)500%，TNF-α與IL-1β mRNA降低，IL-4與IL-10 mRNA升高（圖8F–L，7F）。

圖7. LMMP介導的IDW愈合的體內(nèi)分析。（A）在ICR小鼠模型上評估LMMP效果的實驗設(shè)置示意圖。（B）9天內(nèi)不同處理后的傷口隨時間變化的閉合情況。（C）在第0、3、5、7和9天不同處理后的傷口愈合進程。（D）不同處理后IDW組織中p-PI3K/p-AKT激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（E）不同處理后IDW組織中MAPK-ERK1/2激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（F）不同處理后IDW組織中Nrf2-HO-1激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（G）第4天和第9天受傷皮膚的H&E染色和馬松三色染色結(jié)果

圖8. LMMP加速IDW愈合的體內(nèi)機制研究。（A）不同處理后IDW組織中細胞角蛋白10（K10，綠色）和細胞角蛋白14（K14，紅色）的免疫熒光染色結(jié)果。（B）不同處理后IDW組織中CD31的免疫染色結(jié)果。（C）不同處理后IDW組織中iNOS和CD206的免疫熒光染色結(jié)果。（D、E）細胞角蛋白14（D）和細胞角蛋白10（E）的定量分析結(jié)果。（F）CD31表達的定量分析結(jié)果。（G、H）iNOS（G）和CD206（H）表達的定量分析結(jié)果。（I-L）不同處理后IDW組織中TNF-α（I）、IL-1β（J）、IL-4（K）和IL-10（L）分泌水平的相對表達量