IF：19 《AFM》南加州大學(xué)Zhen Zhao：功能性水凝膠用于調(diào)節(jié)頭部損傷中的脂滴和神經(jīng)炎癥
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2025-10-13
作者：
創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的病理進(jìn)程包括原發(fā)性機(jī)械損傷和繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)。盡管炎癥在損傷初期有助于清除壞死組織并啟動修復(fù)，但過度或持續(xù)的炎癥反而阻礙組織再生、加劇神經(jīng)退行性變并損害長期功能恢復(fù)。
近年來，水凝膠因其可注射、可填充缺損、可遞送活性分子等優(yōu)勢，被廣泛用于TBI修復(fù)；其中明膠-甲基丙烯酰（GelMA）水凝膠因良好的生物相容性、細(xì)胞黏附性和光交聯(lián)能力而備受關(guān)注。然而，傳統(tǒng)GelMA水凝膠僅作為“被動”支架，無法針對TBI后脂質(zhì)代謝紊亂及神經(jīng)炎癥等核心病理環(huán)節(jié)進(jìn)行主動干預(yù)。此外，TBI后局部膽固醇異常升高并誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)滴（LD）積聚，促進(jìn)其向促炎M1表型極化，形成“膽固醇-LD-神經(jīng)炎癥”惡性循環(huán)，但現(xiàn)有水凝膠策略尚未將膽固醇穩(wěn)態(tài)作為治療靶點(diǎn)。因此，亟需開發(fā)一種既能填充損傷腔隙、又能主動調(diào)控膽固醇代謝并緩解神經(jīng)炎癥的“功能性”水凝膠，以實(shí)現(xiàn)TBI后的多維度協(xié)同修復(fù)。
針對TBI后膽固醇異常積聚、脂質(zhì)滴（LD）大量形成并驅(qū)動小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎M1表型極化這一核心病理環(huán)節(jié)，美國南加州大學(xué)Zhen Zhao團(tuán)隊受β-環(huán)糊精（βCD）高效螯合膽固醇特性的啟發(fā)，將甲基-β-環(huán)糊精（MeβCD）共價接枝到明膠-甲基丙烯酰（GelMA）網(wǎng)絡(luò)中，構(gòu)建了一種可注射、可光交聯(lián)的βCD-GelMA功能水凝膠。該水凝膠既可精準(zhǔn)填充TBI造成的缺損腔隙，又能在植入位點(diǎn)持續(xù)“捕獲”過量膽固醇、阻斷LD生成，從而逆轉(zhuǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥極化、抑制膠質(zhì)瘢痕形成并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。體內(nèi)外實(shí)驗證實(shí)，5% βCD-GelMA在力學(xué)上與腦組織匹配，3天內(nèi)即可顯著降低損傷區(qū)膽固醇負(fù)荷，7天內(nèi)將LD水平降至接近正常，同時改善小鼠感覺-運(yùn)動行為。該研究首次將“膽固醇-LD-神經(jīng)炎癥”軸確立為TBI可干預(yù)靶點(diǎn)，并提出“代謝-力學(xué)-免疫”協(xié)同修復(fù)的新策略。相關(guān)工作于2025年07月12日以《Functional Hydrogel for Modulating Lipid Droplets and Neuroinflammation in Head Injury》為題在線發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202507086）。
（1）βCD-GelMA的合成和表征
明膠經(jīng)甲基丙烯酸酐修飾得 GelMA，后與羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-βCD）按 4:3、4:5、4:7 三種摩爾比投料，在 EDC/NHS（4:1:2）催化下生成不同取代度的 βCD-GelMA（圖 1a）。透析后測試 400–600 nm 吸收光譜顯示，4:3、4:5、4:7 樣品的 βCD 含量分別為 24.53 ± 4.15、61.07 ± 4.40 和 137.17 ± 15.27 μM，故選用 4:7 體系用于后續(xù)實(shí)驗。FTIR 光譜中，GelMA 的 C=O 伸縮振動（1500–1690 cm?1）與 βCD 的 C–O 特征峰（1100–1000 cm?1）同時出現(xiàn)在產(chǎn)物中（圖 1b）。1H NMR 進(jìn)一步驗證：8.0–8.5 ppm 酰胺質(zhì)子、5.3–5.5 ppm 雙鍵質(zhì)子及 4.8–5.2 ppm 葡萄糖環(huán)質(zhì)子共存于 βCD-GelMA（圖 1c），證實(shí) βCD 成功接枝。
圖1 βCD-GelMA水凝膠表征。（a）GelMA、βCD-GelMA及其水凝膠的合成示意；（b）GelMA、βCD與βCD-GelMA的FTIR光譜；（c）三者的1H NMR譜；（d）2%、5%、10% βCD-GelMA經(jīng)紫外光交聯(lián)后的成膠狀態(tài)，標(biāo)尺10 mm；（e）5%與10% GelMA或βCD-GelMA水凝膠的形變適應(yīng)性，標(biāo)尺10 mm；（f）5%與10% GelMA或βCD-GelMA的SEM微觀形貌，標(biāo)尺50 μm；（g）對應(yīng)孔徑統(tǒng)計，**p<0.01；（h）5% βCD-GelMA在37 °C下的儲能模量G′與損耗模量G″隨頻率變化；（i）G′與G″定量值；（j）5% βCD-GelMA與8周齡小鼠新鮮腦組織的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線；（k）兩者楊氏模量對比
（2）βCD-GelMA 水凝膠形成和降解的性質(zhì)
圖1d–k顯示βCD-GelMA水凝膠2%、5%、10% (w/v)經(jīng)2 s紫外照射，僅5%與10%形成可倒置自持的固態(tài)凝膠；300 RPM振蕩5 min后，5%體系保持形貌而10%體系不變，提示5%更利于填充不規(guī)則腔隙。SEM測得5% GelMA孔徑331 ± 99 μm，βCD-GelMA孔徑371 ± 142 μm，均大于10%體系（231 ± 35 μm 與 240 ± 48 μm）（圖1f,g）。SH-SY5Y細(xì)胞3天培養(yǎng)未見CM-βCD、GelMA或βCD-GelMA毒性。5% βCD-GelMA在37 °C、1 Hz下儲能模量G′≈0.518 kPa，損耗模量G″≈0.021 kPa（圖1h,i）；壓縮至30%應(yīng)變時，其楊氏模量≈33 Pa，與新鮮小鼠腦組織≈30 Pa匹配（圖1j,k）。FITC標(biāo)記示蹤顯示：PBS中5%與10%水凝膠3天后熒光保留分別為79.19 ± 7.38%與81.96 ± 5.38%，5%體系在5 U mL?1膠原酶中48 h后仍剩余31.82 ± 7.76%，提示5% βCD-GelMA適用于短期體內(nèi)應(yīng)用。
（3）膽固醇誘導(dǎo) LD 積累和隨后的炎癥
Raw264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)10或20 mM膽固醇處理12–24 h后，Oil Red O染色顯示大量脂質(zhì)滴（LDs）形成（圖2a）；BODIPY定量10 mM組LDs達(dá)17.5 ± 5.3個/細(xì)胞（圖2b,c）。膽固醇含量在6 h內(nèi)由0.12 ± 0.02 μg/孔升至1.38 ± 0.39 μg/孔（圖2d），F(xiàn)ilipin染色證實(shí)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平較對照升高>3.5倍（圖2e,f）。βCD-GelMA水凝膠顯著抑制膽固醇誘導(dǎo)的LD積聚（圖2j），降低iNOS表達(dá)、提高CD206水平，使iNOS/CD206比值下降（圖2k–m）；實(shí)時PCR亦顯示iNOS、CD68、IL-6 mRNA下調(diào)，而M2標(biāo)志物Arg1、CD206、Ym1上調(diào)。
圖2 βCD-GelMA體外調(diào)控脂質(zhì)滴（LD）及炎癥表征。（a）RAW264.7細(xì)胞經(jīng)1–20 mM膽固醇處理0–24 h后Oil Red O染色示LD生成；（b）10 mM膽固醇處理12 h后BODIPY熒光圖，標(biāo)尺10 μm；（c）LD計數(shù)定量；（d）10 mM膽固醇作用0–24 h細(xì)胞膽固醇含量；（e）6 h Filipin染色熒光圖，標(biāo)尺10 μm；（f）Filipin熒光強(qiáng)度定量；（g）10 mM膽固醇預(yù)處理6 h后細(xì)胞分別接種于平板、GelMA或βCD-GelMA水凝膠共培養(yǎng)6 h的BODIPY及明場圖，標(biāo)尺20 μm；（h）BODIPY/Hoechst熒光比值定量；（i）對應(yīng)LD熒光圖，箭頭指示LD，標(biāo)尺20 μm；（j）LD計數(shù)定量；（k）iNOS熒光強(qiáng)度（iNOS/Hoechst）定量；（l）CD206熒光強(qiáng)度（CD206/Hoechst）定量；（m）iNOS/CD206比值定量
（4）βCD-GelMA 通過減輕 LD 積累來緩解細(xì)胞炎癥
βCD-GelMA水凝膠顯著減少10 mM膽固醇預(yù)處理的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)滴（LD）數(shù)量，效果優(yōu)于GelMA或空白對照（圖2h），HeLa細(xì)胞亦呈一致趨勢。共培養(yǎng)實(shí)驗中，細(xì)胞跨越GelMA與βCD-GelMA界面時，LD水平隨基材差異而明顯不同（圖2i）。βCD-GelMA進(jìn)一步降低iNOS表達(dá)、提高CD206水平，使iNOS/CD206比值下降（圖2k–m），并下調(diào)iNOS、CD68、IL-6 mRNA，上調(diào)M2標(biāo)志物Arg1、CD206、Ym1，提示其通過消耗LD抑制促炎極化。
圖3 TBI小鼠膽固醇與脂質(zhì)滴積聚表征。（a）Sham及TBI后D3、D7、D14、D21全腦與GFAP/IBA1免疫熒光，標(biāo)尺1 mm；（b）皮層或傷區(qū)GFAP、IBA1單細(xì)胞熒光強(qiáng)度，n=3；（c）傷區(qū)膽固醇含量；（d）BODIPY標(biāo)記LD，標(biāo)尺40 μm；（e）皮層或傷區(qū)LD熒光強(qiáng)度；（f）Filipin膽固醇3D圖與熒光圖；（g）Sham、D3、D7 Filipin熒光圖；（h）Filipin熒光強(qiáng)度定量；（i）Oil Red O染色圖，標(biāo)尺20 μm；（j）Oil Red O陽性面積%；（k）D7 BODIPY/IBA1共定位圖；（l）D7 LD/細(xì)胞計數(shù)；（m）D7 BODIPY/iNOS/CD206共染圖；（n）iNOS?與CD206?細(xì)胞LD計數(shù)
（5）TBI 小鼠模型中膽固醇和 LDs 的積累
CCI模型小鼠傷后小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活（GFAP、IBA1熒光增強(qiáng)）于day 7 post-injury （7 dpi）達(dá)峰（圖3a,b）。損傷區(qū)膽固醇含量3 dpi升至34.72 ± 7.13 mg g?1，7 dpi仍保持30.29 ± 4.97 mg g?1（圖3c）。BODIPY標(biāo)記顯示LD在7 dpi積聚至峰值（圖3d,e），與膠質(zhì)增生同步。Filipin染色證實(shí)3 dpi及7 dpi膽固醇熒光顯著高于假手術(shù)組（圖3f–h）。7 dpi損傷區(qū)細(xì)胞平均>15個BODIPY陽性LD/細(xì)胞，假手術(shù)組極低；Oil Red O于3–7 dpi顯著增強(qiáng)，7 dpi最高（圖3i,j）。7 dpi樣本中，BODIPY-LD與IBA1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞高度共定位，平均13.74個LD/細(xì)胞（圖3k,l），星形膠質(zhì)細(xì)胞未見此現(xiàn)象。共染iNOS/CD206顯示，7 dpi時BODIPY-LD在iNOS?小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著多于CD206?細(xì)胞（圖3m,n），提示膽固醇及LD積聚驅(qū)動小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎M1極化。
（6）βCD-GelMA 水凝膠植入可改善 TBI 后的功能結(jié)果
圖4 TBI后第3天植入βCD-GelMA水凝膠，7 dpi評估顯示：FTIC標(biāo)記確認(rèn)腔隙填充（圖4a）；βCD-GelMA組足誤試驗（圖4b）和轉(zhuǎn)棒試驗（圖4c）自5 dpi起優(yōu)于Vehicle及GelMA組，7 dpi差異顯著（#P<0.05）。7 dpi取材顯示：βCD-GelMA組組織膽固醇11.12 mg g?1，低于Vehicle 34.42 mg g?1及GelMA 33.05 mg g?1（圖4e）；水凝膠自身含膽固醇9.86 mg g?1，為GelMA 3倍（圖4f）。組織學(xué)：βCD-GelMA組損傷周邊脂質(zhì)滴顯著減少，Oil Red O陽性面積最低（圖4i,j）；GFAP（圖4k,l）與IBA1（圖4m,o）熒光強(qiáng)度下降。IBA1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)BODIPY-LD計數(shù)：Vehicle與GelMA組>13/細(xì)胞，βCD-GelMA組幾乎為零。iNOS陽性微膠質(zhì)多與LD共存，βCD-GelMA組LD缺如，CD206陽性比例升高。
圖4 βCD-GelMA水凝膠植入改善TBI小鼠結(jié)局。（a）TBI后3 dpi植入50 μl水凝膠，7 dpi取材實(shí)驗示意圖，右側(cè)為FβCD-GelMA/腦融合圖，標(biāo)尺1 mm；（b,c）Sham、TBI、GelMA、βCD-GelMA組0–7 dpi的足誤試驗和轉(zhuǎn)棒試驗，n=3，*p<0.05 vs Sham，#p<0.05 vs βCD-GelMA；（d）植入水凝膠及腦瘢痕膽固醇分布示意；（e）7 dpi瘢痕組織膽固醇含量，βCD-GelMA組11.12 mg g?1，低于Vehicle 34.42 mg g?1及GelMA 33.05 mg g?1，***p<0.001；（f）GelMA與βCD-GelMA水凝膠內(nèi)膽固醇含量，**p<0.01；（g,h）7 dpi損傷區(qū)BODIPY/IBA1共定位圖及定量，標(biāo)尺40 μm，**p<0.01；（i,j）7 dpi Oil Red O染色圖及陽性面積%，標(biāo)尺20 μm，*p<0.05；（k,l）7 dpi GFAP熒光圖及定量，標(biāo)尺1 mm，*p<0.05；（m,n）7 dpi IBA1偽彩圖及定量，標(biāo)尺1 mm，*p<0.05；（o）7 dpi IBA1免疫熒光及3D強(qiáng)度圖，標(biāo)尺1 mm
該研究團(tuán)隊將甲基-β-環(huán)糊精（MeβCD）接枝到明膠-甲基丙烯酰（GelMA）骨架，構(gòu)建出5%（w/v）βCD-GelMA可注射光交聯(lián)水凝膠。βCD提供環(huán)狀疏水腔，可高效螯合膽固醇；GelMA賦予可調(diào)的力學(xué)性能（G′≈0.518 kPa，G″≈0.021 kPa，37 °C）及與腦組織匹配的楊氏模量（≈33 Pa vs ≈30 Pa），確保界面應(yīng)力最小化。膠原酶降解48 h后仍留存31.82 ± 7.76%，滿足短期修復(fù)需求。植入TBI小鼠第3天缺損腔后，7 dpi時水凝膠內(nèi)膽固醇濃度達(dá)9.86 mg g?1，為GelMA對照的3倍；組織膽固醇由34.42 mg g?1（Vehicle）降至11.12 mg g?1，BODIPY-LD由>13/細(xì)胞降至接近零，Oil Red O陽性面積顯著減少。伴隨膽固醇-LD軸的恢復(fù)，GFAP與IBA1熒光強(qiáng)度下降，M1標(biāo)志iNOS下調(diào)、M2標(biāo)志CD206上調(diào)。行為學(xué)證實(shí)βCD-GelMA組自5 dpi起轉(zhuǎn)棒與足誤成績顯著優(yōu)于Vehicle和GelMA組，7 dpi差異持續(xù)（#P<0.05）。因此，βCD-GelMA水凝膠通過局部膽固醇“捕獲-清除”機(jī)制，重塑小膠質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝和極化狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)TBI后的代謝-免疫-力學(xué)協(xié)同修復(fù)，為神經(jīng)創(chuàng)傷提供一種可轉(zhuǎn)化的精準(zhǔn)生物材料策略。
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