IF：20.3《BAM》四川大學吳堯：自噬激活納米系統(tǒng)通過原位線粒體新生與細胞間轉移實現(xiàn)衰老骨骼再生
專欄：學術前沿
發(fā)布日期：2025-10-10
作者：
研究背景：
衰老性骨質疏松（SOP）隨增齡隱匿發(fā)生，全球患者已逾2億，骨折風險高、致殘率高，成為老齡化社會沉重負擔。傳統(tǒng)研究將病理核心歸于骨髓間充質干細胞（BMSCs）衰老，其成骨-成脂分化失衡導致骨形成減少、骨髓脂肪增多。然而，近年發(fā)現(xiàn)衰老單核/巨噬細胞（S-BMDMs）通過分泌SASP因子和胞外囊泡，把DNA損傷、線粒體功能障礙及炎癥信號“傳染”給BMSCs，形成“衰老-炎癥-骨丟失”惡性循環(huán)，提示僅靶向BMSCs療效有限，須重塑免疫-干細胞互作。
線粒體質量控制是維持骨骼穩(wěn)態(tài)的關鍵；健康線粒體為成骨供能并調控鈣磷代謝，而功能障礙線粒體釋放過量ROS與mtDNA碎片，激活炎癥小體，進一步加劇衰老。線粒體移植已在多器官損傷中顯效，但SOP患者自身BMSCs線粒體已受損，不宜作供體。骨髓中豐富的S-BMDMs若能恢復線粒體功能，不僅可逆轉自身衰老，還可能通過隧道納米管等途徑將健康線粒體原位遞送給BMSCs，實現(xiàn)“免疫-干細胞”雙向能量補給。然而，S-BMDMs同樣存在ROS蓄積、自噬流阻斷及線粒體損傷，如何先行恢復其線粒體穩(wěn)態(tài)成為關鍵。自噬可清除受損線粒體并重建能量代謝，但其活性隨齡下降。
鈰納米顆粒（Ce NPs）具多重ROS清除酶活性，α-酮戊二酸（α-KG）可提高線粒體呼吸并激活自噬。構建α-KG-Ce納米復合體系，有望原位重塑S-BMDMs線粒體健康，進而驅動其向S-BMSCs線粒體捐贈，為衰老骨髓微環(huán)境帶來能量與信號雙重“青春化”，開辟SOP精準干預新途徑。
針對上述問題，四川大學吳堯構建了α-酮戊二酸修飾鈰金屬有機框架納米系統(tǒng)（CNS）通過雙重機制實現(xiàn)衰老性骨質疏松的逆轉：一方面，CNS激活自噬-SIRT1-PGC-1α軸，重建衰老骨髓巨噬細胞（S-BMDMs）的氧化還原穩(wěn)態(tài)并促進線粒體新生，使其轉化為抗炎M2表型；另一方面，功能恢復的S-BMDMs作為"線粒體充電站"，通過細胞間轉移將健康線粒體遞送給衰老骨髓間充質干細胞（S-BMSCs），恢復其成骨分化能力并抑制脂肪分化。這種“先重塑免疫細胞線粒體，再拯救干細胞功能”的序貫策略，顯著改善骨微環(huán)境并促進體內骨再生，為衰老相關骨缺損治療提供了創(chuàng)新性納米醫(yī)學方案。該文章于2025年8月5日以《Autophagic-active nanosystem for senile bone regeneration by in-situ mitochondrial biogenesis and intercellular transfer》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.07.034）。
Scheme 1. S-BMDMs胞內改變及CNS保護作用的示意圖
（1）CNS的制備與表征
圖1A所示合成路線以三嵌段共聚物F127/P123為模板，先制備出~150 nm、介孔結構清晰的八面體CeMOF，再依次接枝PEI與α-KG，得到終產(chǎn)物CNS。SEM/TEM（圖1B–C）顯示CeMOF與CNS均呈規(guī)則八面體、單分散，粒徑約150 nm；氮氣吸附-脫附等溫線（圖1D）表明介孔孔道結構在修飾后依然保留，比表面積及孔徑分布無顯著差異。FTIR在1680 cm-1處出現(xiàn)α-KG酰胺鍵羰基特征峰（圖1E），TGA顯示CNS有機組分失重明顯高于CeMOF及PEI-CeMOF（圖1F）?？寡趸δ茉u價顯示，CNS清除·DPPH的效率較CeMOF提升約1.4倍（圖1G–H），·O2-（圖1I–J）與H2O2（圖1K–L）清除率亦顯著優(yōu)于CeMOF。
圖1. CNS的合成與表征。(A) CNS制備流程示意圖；(B) CeMOF與CNS的SEM圖像；(C) 顯示CeMOF與CNS介孔結構的TEM圖像；(D) CNS的N2吸附-脫附等溫線；(E) CeMOF、PEI-CeMOF與CNS的FTIR光譜；(F) CeMOF、PEI-CeMOF與CNS的TGA曲線。(G, H) CeMOF與CNS的總ROS清除活性；(I, J) CeMOF與CNS的類SOD活性；(K, L) CeMOF與CNS的類CAT活性
（2）CNS通過激活自噬清除S-BMDMs胞內ROS并恢復細胞活力
MitoSOX熒光成像與DCFH-DA流式檢測共同表明，CNS處理組線粒體ROS和總ROS分別被清除至≈98 %和>97 %，效果明顯優(yōu)于CeMOF與α-KG（圖2A–B）。CCK-8增殖試驗和β-半乳糖苷酶衰老染色顯示，CNS使細胞活力恢復至接近正常水平并顯著降低衰老陽性率（圖2C–D）；qRT-PCR進一步證實其下調衰老相關基因P16、P21及SASP因子MMP9、TNF-α的表達，降幅優(yōu)于CeMOF和α-KG（圖2E）。在自噬方面，CNS顯著提高LC3B/3A比值及Atg5、Beclin1表達，同時降低P62水平，免疫熒光顯示Beclin1蛋白熒光強度最高（圖2F–H）。qRT-PCR與免疫熒光顯示抗炎基因IL-1RA、IL-10上調，促炎基因iNOS、IL-6下調，CD206熒光顯著增強（圖2I–K），證實CNS依賴自噬激活逆轉S-BMDMs衰老并促其向抗炎表型轉換（圖2L）。
圖2. CNS通過激活自噬增強S-BMDMs活性并調控其抗炎表型轉換。(A) MitoSOX（紅色）檢測CeMOF、α-KG及CNS處理后S-BMDMs的mtROS水平；(B) 流式細胞術測定不同樣品處理后S-BMDMs胞內ROS含量；(C) CCK-8法檢測衰老細胞在各處理組中的活性；(D) β-Gal染色顯示衰老與CNS處理S-BMDMs的衰老程度；(E) qRT-PCR檢測衰老標志物P16與P21的表達；(F) qRT-PCR檢測自噬相關基因LC3B/3A、Atg5、Beclin1及P62的表達；(G) 免疫熒光圖像顯示各組自噬標志物Beclin1的表達；(H) Beclin1熒光強度的定量分析；(I) qRT-PCR檢測抗炎標志物IL-1RA與IL-10的表達；(J) qRT-PCR檢測促炎標志物iNOS與IL-6的表達；(K) 免疫熒光圖像顯示各組抗炎標志物CD206的表達；(L) CNS增強S-BMDMs活性并調控其極化表型的示意圖
（3）CNS通過自噬激活改善S-BMDM中的線粒體狀態(tài)
TEM觀察顯示，CNS處理組細胞內可見明顯自噬體結構（圖3A黃色標記），且線粒體形態(tài)完整，嵴結構清晰，基質致密；相較之下，衰老組線粒體腫脹、嵴斷裂或消失。Mitotracker熒光染色進一步證實，CNS可重建連續(xù)的管狀線粒體網(wǎng)絡，逆轉衰老組中因過度分裂導致的點狀或短棒狀碎片化現(xiàn)象（圖3B）。JC-1探針檢測線粒體膜電位（ΔΨm）結果顯示，CNS組紅/綠熒光比值顯著高于衰老組，亦優(yōu)于CeMOF與α-KG組，表明其更有效地恢復線粒體功能（圖3C）。ATP生成實驗表明，CNS處理使細胞內ATP水平明顯升高，而加入自噬抑制劑3-MA后，ATP產(chǎn)量顯著下降（圖3D–G）。綜上，CNS通過增強自噬活性，修復線粒體超微結構，恢復其能量合成能力，并協(xié)同促進M2型極化。
圖3. CNS通過激活自噬清除ROS并恢復線粒體穩(wěn)態(tài)。(A) TEM觀察CNS處理前后S-BMDMs自噬體（黃圈）與線粒體（黃箭頭）；(B) CLSM觀察CNS處理前后S-BMDMs線粒體形態(tài)；(C) JC-1檢測不同樣品處理后線粒體膜電位的熒光圖像；(D) 不同樣品處理后ATP熒光染色圖像；(E) 不同樣品處理后ATP定量檢測；(F) 加入3-MA后ATP熒光染色圖像；(G) 加入3-MA后ATP熒光相對密度定量分析
（4）CNS通過線粒體轉移促進S-BMDM和S-BMSC之間的細胞間串擾
線粒體轉移實驗采用MitoTracker Deep Red標記S-BMDMs、MitoTracker Green標記S-BMSCs，共培養(yǎng)24小時后共聚焦成像顯示，CNS預處理的S-BMDMs（CNS-S-BMDMs）向靶細胞轉移的紅色線粒體熒光面積和強度均顯著高于未處理衰老組，定量共定位分析證實其轉移效率提升約1.8倍（圖4A–B）?？缈祝?.4 μm）體系顯示轉移效率下降60 %以上，且Cytochalasin D阻斷隧道納米管（TNT）形成后轉移量顯著降低，直接捕獲到TNT內紅色線粒體移動的連續(xù)圖像，表明接觸依賴的TNT是主要轉移途徑（圖4C–E）。在體驗證中，將標記好的S-BMDMs經(jīng)尾靜脈注入老齡大鼠，流式檢測CD90?/CD44? S-BMSCs內的紅色熒光信號顯示，CNS-S-BMDMs組的線粒體轉移效率較衰老組提高約5倍（圖4F）。分化功能實驗顯示，來源于CNS-S-BMDMs的M2型線粒體顯著增強S-BMSCs的ALP活性、茜素紅礦化結節(jié)面積，并抑制油紅O脂滴形成；而LPS刺激的BMDMs條件培養(yǎng)基環(huán)境則削弱上述成骨優(yōu)勢，提示線粒體轉移的促成骨效應依賴于抗炎微環(huán)境（圖4G–H）。
圖4. CNS促進骨微環(huán)境中S-BMDMs向S-BMSCs的線粒體轉移。(A) 共聚焦圖像：MitoTracker Green標記S-BMSCs（綠）、MitoTracker Deep Red標記S-BMDMs（紅）、Hoechst 33342染核（藍），24 h共培養(yǎng)±CNS；(B) 直接共培養(yǎng)后隨機區(qū)三色熒光共定位統(tǒng)計；(C) TW系統(tǒng)共培養(yǎng)24 h共聚焦圖像；(D) TW系統(tǒng)共培養(yǎng)后隨機區(qū)三色熒光共定位統(tǒng)計；(E) 免疫熒光：Miro1（灰）與Deep Red-線粒體（紅）在TNT中共定位，鬼筆環(huán)肽標記肌動蛋白（綠）；(F) 流式定量CNS-S-BMDMs向S-BMSCs的線粒體轉移效率；(G–H) ALP與ARS染色監(jiān)測不同條件下S-BMSCs成骨分化：Ⅰ. CNS-S-BMDMs來源線粒體；Ⅱ. 普通BMDMs來源線粒體；Ⅲ. 單純CNS；Ⅳ. LPS條件培養(yǎng)基+CNS；Ⅴ. CNS+CNS-S-BMDMs線粒體；Ⅵ. LPS條件培養(yǎng)基+CNS+CNS-S-BMDMs線粒體
（5）CNS激活自噬以調節(jié) S-BMDM 的抗炎表型開關并促進線粒體生物發(fā)生
轉錄組結果顯示，CNS組比衰老組多267個上調基因，其中48個集中富集于自噬、線粒體自噬、溶酶體等8條KEGG通路；qPCR驗證負調控基因Mtor、Bcl2顯著下調，而正調控基因Atg3、Atg5、Atg10、Atg12、Ambra1、Vps34、Bnip3、Ddit3均顯著上調，覆蓋自噬啟動、膜延伸、貨物識別及自噬體形成全過程（圖5A–E）。免疫-自噬關聯(lián)分析顯示M1型基因與自噬基因呈強負相關，M2型基因與自噬基因呈強正相關，提示自噬是表型轉換的核心調控節(jié)點（圖5F）。差異基因同時富集于氧化磷酸化、谷胱甘肽代謝和NAD+代謝；STRING構建的PPI網(wǎng)絡進一步將自噬與線粒體電子傳遞、NADH-泛醌氧化、質子跨膜信號耦合，預測自噬可增強呼吸鏈效率并保護NAD+水平（圖5G）。CNS處理后S-BMDMs內SIRT1、PGC-1α、TFAM、Nrf2 mRNA水平顯著高于衰老組；加入SIRT1抑制劑EX527后，上述基因表達上調被顯著抑制（圖5H），直接證明CNS通過激活SIRT1-PGC-1α-NRF2-TFAM軸促進線粒體生物發(fā)生。
圖5. 轉錄組測序分析。(A) 自噬通路示意圖；(B) 對照、衰老與CNS三組間差異基因數(shù)量；(C) 48個差異自噬相關基因KEGG富集的環(huán)形圖；(D) 衰老組與CNS組顯著差異基因表達熱圖；(E) 上調差異基因KEGG通路富集結果；(F) Pearson相關性分析，顏色強度代表相關系數(shù)?1至1（綠到紅）；(G) 差異基因互作網(wǎng)絡圖；(H) qRT-PCR驗證SIRT1、PGC-1α、Nrf2與TFAM基因表達
（6）SPEEK-CNS支架調節(jié)SOP中的骨微環(huán)境
磺化聚醚醚酮（SPEEK）通過濃硫酸處理在表面生成多孔微結構，并利用聚多巴胺（PDA）中間層實現(xiàn)10 μg/mL CNS的牢固接枝，獲得SPEEK-CNS支架。在每周一次多柔比星（Dox）腹腔注射、持續(xù)4周建立的加速衰老骨質疏松大鼠模型（圖6A），隨后于股骨遠端制造直徑2 mm貫穿缺損并植入支架，分三組：SPEEK（陰性）、SPEEK-?；撬幔栃裕┡cSPEEK-CNS。術后2周和4周取材，免疫熒光及定量分析顯示：SPEEK-CNS組CD86?促炎信號最低，CD206?抗炎信號最高，表明局部免疫微環(huán)境向M2型極化（圖6B–D）。衰老標志物P21在SPEEK-CNS組表達量在各時間點均顯著低于其余兩組，下降幅度隨時間延長而擴大（圖6E–G）。結果證實，SPEEK-CNS支架可在衰老骨缺損區(qū)持續(xù)釋放CNS，通過抑制炎癥和細胞衰老，創(chuàng)造有利于骨再生的免疫微環(huán)境。
圖6. 體內評估CNS對SOP骨微環(huán)境的調控能力。(A) 動物實驗流程示意圖；(B) SPEEK、SPEEK-牛磺酸與SPEEK-CNS支架中抗炎標志物CD206及促炎標志物CD86的免疫熒光圖像；(C) CD86熒光相對密度定量分析；(D) CD206熒光相對密度定量分析；(E) 術后2周與4周時，SPEEK、SPEEK-牛磺酸與SPEEK-CNS支架中衰老標志物P21的免疫熒光圖像；(F) 術后2周P21熒光相對密度定量分析；(G) 術后4周P21熒光相對密度定量分析
（7）SPEEK-CNS支架的體內成骨整合
免疫熒光顯示，SPEEK-CNS組新生骨區(qū)域內PGC-1α（綠色）與Miro1（紅色）雙陽性細胞數(shù)量顯著多于其余兩組，表明線粒體生物發(fā)生及轉移活性最高（圖7A）。術后4周micro-CT三維重建可見該組植入體周圍被連續(xù)、致密的新骨包裹，骨體積分數(shù)（BV/TV）和骨小梁連接密度（Conn.D）均顯著升高，骨小梁分離度（Tb.Sp）明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（圖7B–E）。H&E組織學切片進一步證實，SPEEK-CNS支架周圍新骨形成均勻且連續(xù)，成骨質量優(yōu)于SPEEK和SPEEK-?；撬釋φ眨▓D7F）。
圖7. CNS促進SOP骨形成評價。(A) 股骨樣本Miro1與PGC-1α雙標免疫熒光圖；(B) 術后4周SPEEK、SPEEK-?；撬峒癝PEEK-CNS支架新生骨3D micro-CT重建圖；(C) micro-CT參數(shù)BV/TV定量；(D) micro-CT參數(shù)Conn.D定量；(E) micro-CT參數(shù)Tb.Sp定量；(F) HE染色觀察術后2周與4周三組支架周圍新生骨組織
總之，該團隊提出“原位提升線粒體新生-轉移”策略治療衰老性骨質疏松：CNS通過激活自噬降低ROS、協(xié)同α-KG增強TCA循環(huán)恢復NAD+，進而放大SIRT1-PGC-1α信號，驅動S-BMDMs線粒體生物發(fā)生；功能重塑的S-BMDMs經(jīng)隧道納米管向S-BMSCs高效轉移健康線粒體，逆轉靶細胞衰老、增強成骨分化并抑制脂肪分化。該工作揭示了生物材料調控骨髓微環(huán)境線粒體穩(wěn)態(tài)與成骨免疫平衡的新機制，為年齡相關骨質疏松提供了可轉化的“能量充電-細胞間遞送”治療范式。
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