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圖2. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的表征。A) 不同GA與PTD-sp質(zhì)量比的GA-siTNFα-PS的siRNA負(fù)載效率，B) Zeta電位，C) 粒徑。D) GA-siTNFα-PS的TEM圖像。E) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel自固化過程。F) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的流變學(xué)性質(zhì)。G) 不同DA-OIn濃度的GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的凝膠時(shí)間。H) GA-siTNFα-PS在SHE-Gel中的包封效率（n = 3）。I) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的可注射性。J) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在小鼠胃中的自固化過程。K) 自愈合能力示意圖。L) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的機(jī)制。M) 不同DA-OIn濃度的GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗壓強(qiáng)度。N) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（用藍(lán)墨水染色）對小鼠結(jié)腸的強(qiáng)效粘附。O-P) 不同DA-OIn濃度和GA-siTNFα-PS濃度下GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在豬皮上的粘附強(qiáng)度

（2）GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗氧化和抗炎能力

研究了包封Cy5標(biāo)記的siTNFα（Cy5-siTNFα）的GA-siTNFα-PS的細(xì)胞攝取情況，游離siRNA很難進(jìn)入細(xì)胞，而聚合物囊泡可以將siRNA遞送到細(xì)胞內(nèi)（圖3A）。使用LPS刺激的巨噬細(xì)胞（LPS組）研究了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗氧化能力，該組顯示出最強(qiáng)烈的ROS熒光（45.8%）（圖3B和C），GA-siTNFα-PS/SHE-Gel顯示出優(yōu)異的ROS清除效果，這源于水凝膠表面的多巴胺和巰基以及GA-siTNFα-PS中的沒食子酸的協(xié)同抗氧化作用。通過評估M1巨噬細(xì)胞相關(guān)因子TNF-α、IL-6和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-10的細(xì)胞因子表達(dá)，進(jìn)一步評估了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗炎能力（圖3D-F）。與水凝膠SHE-Gel和SO-Gel相比，該水凝膠表現(xiàn)出最高的TNF-α和IL-6抑制能力，這歸因于水凝膠中DA-OIn和SH-SA的抗氧化能力，以及GA-siTNFα-PS提供的ROS清除活性和TNF-α沉默能力的協(xié)同效應(yīng)。同時(shí)，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel顯著上調(diào)了M2相關(guān)的IL-10，表明它通過抑制M1巨噬細(xì)胞極化和促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化從而發(fā)揮了優(yōu)異的抗炎作用。

圖3. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗氧化和抗炎能力。A) LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞與Cy5-siTNFα、Cy5-siTNFα-PS、GA-Cy5-siTNFα-PS孵育4小時(shí)或8小時(shí)后的CLSM圖像。比例尺，25 μm。B) 細(xì)胞內(nèi)ROS染色圖像。C) 不同處理后DCFH標(biāo)記的RAW264.7細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析，比例尺，200 μm。D-F) 細(xì)胞外TNF-α、IL-6和IL-10表達(dá)的ELISA結(jié)果（n = 3）

（3）胃腸道穩(wěn)定性和結(jié)腸響應(yīng)性降解

在模擬結(jié)腸液（SCF）或含有微生物特異性菊粉酶的SCF中研究了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的微生物響應(yīng)性降解能力和藥物釋放。SEM顯示，水凝膠在SCF中孵育4或12小時(shí)后發(fā)生溶脹且孔徑增大（圖4A），探索了GA-siTNFα-PS的體內(nèi)遞送效率，DSS + Cy5-PS組由于Cy5-PS的胃腸道不穩(wěn)定性，腹部熒光持續(xù)時(shí)間短。與DSS + Cy5-PS/SO-Gel組相比，DSS + Cy5-PS/SHE-Gel組小鼠腹部的熒光強(qiáng)度在24小時(shí)內(nèi)保持高水平（圖4B-E），表明GA-siTNFα-PS/SHE-Gel具有胃腸道穩(wěn)定性，并由于DA-OIn網(wǎng)絡(luò)中的兒茶酚結(jié)構(gòu)而延長了腸道滯留時(shí)間。Cy5-PS在UC小鼠結(jié)腸中顯示出比健康小鼠結(jié)腸更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度（圖4F和G），即發(fā)炎結(jié)腸區(qū)域積聚豐富的帶正電蛋白質(zhì)，帶負(fù)電的納米顆?？梢酝ㄟ^靜電相互作用歸巢到該區(qū)域。這些結(jié)果表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel經(jīng)歷胃收縮、腸道逐漸溶脹以及在結(jié)腸中菊粉酶響應(yīng)性釋放GA-siTNFα-PS，最終實(shí)現(xiàn)GA-siTNFα-PS對發(fā)炎結(jié)腸部位的靜電靶向。GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在胃中自固化、在腸道滯留并在結(jié)腸微生物響應(yīng)性降解的機(jī)制, 其中釋放的GA-siTNFα-PS可通過靜電相互作用富集在發(fā)炎結(jié)腸（圖4H）。

圖4. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel抵抗胃液，延長腸道滯留時(shí)間，并最終以微生物組響應(yīng)方式在結(jié)腸降解。A) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在不同模擬液中孵育不同時(shí)間后的SEM圖像。B) UC小鼠或健康小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的體內(nèi)成像以及C) 灌胃Cy5標(biāo)記的GA-siTNFα-PS（Cy5-PS）、Cy5-PS/SO-Gel或Cy5-PS/SHE-Gel 24小時(shí)后UC或健康小鼠結(jié)腸的離體圖像，以及它們對應(yīng)的D) 小鼠體內(nèi)成像和E) 結(jié)腸離體圖像的熒光半定量分析（n = 3）。F) UC或健康小鼠結(jié)腸與Cy5-PS培養(yǎng)1小時(shí)并用PBS洗滌（3次）后的體外圖像和G) 熒光半定量分析（n = 3）。H) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在胃中自固化、在腸道滯留并在結(jié)腸微生物響應(yīng)性降解的機(jī)制，其中釋放的GA-siTNFα-PS可通過靜電相互作用富集在發(fā)炎結(jié)腸

（4）GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在UC小鼠模型中的良好治療效果

通過讓小鼠飲用DSS溶液（3%，w/v）7天建立DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型。在第二天口服給予各種水凝膠（圖5A）。結(jié)果表明，口服SHE-Gel（G1）、GA-PS/SHE-Gel（G2）、siTNFα-PS/SHE-Gel（G3）和GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）后，結(jié)腸炎小鼠的炎癥進(jìn)展得到抑制，證據(jù)包括降低的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）（圖5B）、體重減輕抑制（圖5C）和結(jié)腸長度恢復(fù)（圖5D和E）。H&E染色結(jié)果顯示，與siTNFα-PS/SHE-Gel（G3）、GA-PS/SHE-Gel（G2）和SHE-Gel組（G1）相比，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）治療更有效地抑制了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷，表現(xiàn)為隱窩結(jié)構(gòu)破壞減輕、杯狀細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)和炎癥細(xì)胞浸潤減輕（圖5F）。GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的強(qiáng)大炎癥抑制效果可能歸因于GA-siTNFα-PS中的GA清除了細(xì)胞內(nèi)ROS，通過保護(hù)siTNFα完整性提高了TNFα沉默效率，此外還有SHE-Gel的抗氧化能力。這表明GA-siTNFα-PS/SHE-Gel可以有效阻斷DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥過程并維持腸道屏障功能。同時(shí)，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel組結(jié)腸促炎細(xì)胞因子（TNFα和IL-6）的mRNA水平被有效抑制（圖5G和H），而與PBS組相比，抗炎因子IL-10和組織修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的mRNA水平升高（圖5I和J）。此外，分析了結(jié)腸中的巨噬細(xì)胞類型（圖5K），經(jīng)GA-siTNFα-PS/SHE-Gel治療后，M1巨噬細(xì)胞含量顯著減少，M2巨噬細(xì)胞含量顯著增加。同時(shí)，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel治療顯著減弱了DSS誘導(dǎo)的炎癥結(jié)腸組織中髓過氧化物酶（MPO）的陽性表達(dá)（圖5L）。這些發(fā)現(xiàn)表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel有效調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激，并促進(jìn)M1向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而治療DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

圖5. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中的治療性能。A) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。給小鼠提供3% DSS無菌水7天。從第二天開始口服給藥，第八天處死小鼠。B)和 C) DAI評分和體重（n = 6）。D)和 E) 結(jié)腸長度測定（n = 6）。F) 結(jié)腸組織的代表性H&E染色圖像。G-J) 結(jié)腸TNFα、IL-6、IL-10和TGF-β的mRNA水平（n = 3）。K) 結(jié)腸組織中M1巨噬細(xì)胞（CD80（紅色）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；藍(lán)色））和M2巨噬細(xì)胞（CD163（綠色）和DAPI（藍(lán)色））的免疫熒光分析。L) 結(jié)腸組織中MPO的免疫組織化學(xué)染色。(比例尺，200 μm)

（5）GA-siTNFα-PS/SHE-Gel對UC小鼠腸道微生物群的調(diào)控作用

腸道微生物群的失調(diào)與小鼠DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)展密切相關(guān)。通過16S核糖體RNA基因V3-V4區(qū)測序檢測了腸道微生物組的變化。根據(jù)操作分類單元（OTU）的chao、simpson和shannon指數(shù)，經(jīng)PBS或水凝膠處理后，腸道微生物組的豐富度和多樣性沒有差異（圖6A–C）。這可能是因?yàn)榻Y(jié)腸炎的持續(xù)時(shí)間較短。主坐標(biāo)分析（PCA）顯示，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）顯著改變了DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的微生物群落組成（圖6D），并且與對照組相似。siTNFα-PS/SHE-Gel組（G3）和GA-PS/SHE-Gel組（G2）接近G4，而SHE-Gel組（G1）顯示出遠(yuǎn)離DSS組并更接近G3和G2的趨勢。

屬水平（圖6E）和科水平（圖6F）的一般腸桿菌組成分別通過柱狀圖和熱圖顯示?？诜HE-Gel（G1）、GA-PS/SHE-Gel（G2）、siTNFα-PS/SHE-Gel（G3）和GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）后，屬水平的微生物組組成得到改善。特別是，G4顯示出顯著增加的有益菌_norank-f-Muribaculaceae、Turicibacter和Lactobacillus_的豐度，以及減少的_Escherichia-Shigella_（一種引起腸道感染并加重腸炎的有害病原體）的相對豐度。接下來，在科水平上定量分析了幾種特殊細(xì)菌（圖6G–J）。GA-siTNFα-PS/SHE-Gel處理顯著保留了Muribaculaceae（維持健康腸道穩(wěn)態(tài)的主要腸道微生物群）、Lactobacillaceae（促進(jìn)腸道平衡并增強(qiáng)宿主免疫力）和_Bifidobacteriaceae_（改善由免疫系統(tǒng)紊亂引起的潰瘍性結(jié)腸炎）的相對豐度。而Enterobacteriaceae（一類常見的人畜共患病原體或主要人類病原體）則顯著減少。這些結(jié)果表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel通過有效促進(jìn)有益菌生長和減少有害菌，積極調(diào)節(jié)腸道微生物群。此外，通過測量治療7天后小鼠血清中TNF-α、IL-6和TGF-β的水平，評估了水凝膠對DSS誘導(dǎo)的全身性炎癥的影響。結(jié)果顯示，給予DSS 7天后，TNF-α和IL-6升高。經(jīng)SHE-Gel（G1）治療后，它們的水平降低，這歸因于SH-SA的流體抗炎作用與DA-OIn的ROS清除和菌群調(diào)節(jié)的協(xié)同效應(yīng)（圖6K–M）。

圖6. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel調(diào)節(jié)的腸道微生物群分析。 A) Chao, B) Simpson, 和 C) shannon指數(shù)，顯示觀察到的操作分類單元（OTU）的α多樣性（n = 6）。D) 主坐標(biāo)分析顯示腸道微生物組的β多樣性（n = 6）。E) 屬水平的群落柱狀圖（n = 5）。F) 科水平的群落熱圖分析（n = 5）。從F中收集的G) Muribaculaceae, H) Lactobacillaceae, I) Bifidobacteriaceae, 和 J) Enterobacteriaceae的相對豐度（n = 5）。K–M) 血清TNFα、IL-6和TGF-β濃度（n = 3）

（6）GA-siTNFα-PS/ SHE-Gel聯(lián)合抗TNFα抗體治療晚期結(jié)腸炎模型的有效性

研究了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（Gel）、英夫利昔單抗（iv）和Gel + 英夫利昔單抗（iv）在通過自由飲用3% DSS無菌水七天建立的晚期結(jié)腸炎中的治療效果，治療從第八天開始（圖7A）。Gel給藥抑制了晚期UC小鼠的體重減輕（圖7B），恢復(fù)了縮短的結(jié)腸長度（圖7C和D）并減少了脾臟重量。Gel治療與英夫利昔單抗（iv）具有相似的治療效果，這可能歸因于在siTNFα轉(zhuǎn)染之前，DA-OIn中的DA和GA-siTNFα-PS中的GA具有快速的ROS清除能力。Gel + 英夫利昔單抗治療有效緩解了晚期UC小鼠的癥狀，所有指標(biāo)均接近正常小鼠（對照組）。H&E染色結(jié)果顯示，Gel + 英夫利昔單抗保留了結(jié)腸組織完整性，并維持了與對照組相似的杯狀細(xì)胞數(shù)量（圖7E）。此外，Gel + 英夫利昔單抗治療后ZO-1的表達(dá)顯著增加（圖7F）。這些發(fā)現(xiàn)表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel加英夫利昔單抗可以有效改善晚期結(jié)腸炎模型中的炎癥微環(huán)境并恢復(fù)腸上皮屏障功能。

探索了Gel + 英夫利昔單抗的治療機(jī)制。Gel + 英夫利昔單抗組結(jié)腸M1相關(guān)促炎細(xì)胞因子TNFα和IL-6的mRNA水平被有效抑制，而M2相關(guān)IL-10和TGF-β的表達(dá)增加（圖S31，支持信息），接近對照組。此外，與PBS組相比，Gel + 英夫利昔單抗顯著降低了結(jié)腸組織中MPO的陽性表達(dá)（圖7G）。這些結(jié)果表明，Gel + 英夫利昔單抗可以通過抑制氧化應(yīng)激和促進(jìn)M1向M2轉(zhuǎn)化來有效治療晚期UC小鼠。我們根據(jù)OTU的chao、ace和sobs指數(shù)，Gel + 英夫利昔單抗治療增加了腸道微生物組的豐富度和多樣性（圖7H–K），盡管shannon指數(shù)沒有顯著差異。PCA顯示，Gel + 英夫利昔單抗治療顯著改變了晚期結(jié)腸炎小鼠的微生物群落組成。Gel + 英夫利昔單抗組屬水平的微生物組組成顯著改善，并保持了與對照組相似的組成。接下來，在科水平上定量分析了幾種特殊細(xì)菌（圖7L–O）。Gel + 英夫利昔單抗治療顯著保留了有益菌Muribaculaceae、_Akkermansiaceae和Erysipelotrichaceae_的相對豐度。而有害菌_Enterococcaceae_則顯著減少。這些結(jié)果表明，在晚期結(jié)腸炎模型中，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel聯(lián)合英夫利昔單抗通過增加有益菌豐度和減少有害菌積極調(diào)節(jié)了腸道微生物群。

圖7. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel加英夫利昔單抗在晚期結(jié)腸炎模型中的治療性能。A) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。給小鼠提供含有3% DSS的無菌水7天。治療從第8天開始，連續(xù)進(jìn)行7天。所有小鼠在第15天處死。B) 記錄每日體重變化（n = 5）。C) D) 測量和分析結(jié)腸長度（n = 5）。E) 各組結(jié)腸組織的代表性H&E染色圖像。F) ZO-1的免疫熒光分析。G) 結(jié)腸組織中MPO的免疫組織化學(xué)染色。H) Chao, I) ace, J) sobs, 和 K) 觀察到的OTU的shannon指數(shù)（n = 5）。從科水平群落熱圖分析收集的L) Muribaculaceae, M) Akkermansiaceae, N) Erysipelotrichaceae, 和O) Enterobacteriaceae的相對豐度（n = 5）。(比例尺，200 μm)