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圖1. BGCN的特征。a)BGCN的X射線衍射圖；b)Mn 2p的XPS譜；c)O 1S的XPS譜；d)BGCN的TEM電子顯微鏡圖像；e)BGCN的高分辨率電子顯微鏡圖像；f)BGCN的透射電子顯微鏡元素圖譜；g)BGCN的FTIR光譜；h)BGCN的氮吸附/脫附等溫線；i)BGCN的孔徑分布

（2）納米酶及其體外抗菌活性

超氧化物歧化酶通過清除超氧陰離子自由基，具有促進傷口修復的能力。圖2a~c顯示BGCN對O2·?具有較強的清除能力，當濃度為1 mg/mL時，其清除率可達60%以上，這是單個二氧化硅納米粒子所不具備的性能。圖2d~f表明BGCN 能分解 H?O? 并產(chǎn)生大量 O?，表現(xiàn)出類似在人體內(nèi)，過氧化氫的清除主要依賴于過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。通過監(jiān)測過氧化氫酶分解過氧化氫的產(chǎn)物O2(圖2d)的產(chǎn)生證明了BGCN具有類似CAT的酶活性。圖2e顯示1 mg/mL BGCN的氧濃度在90 s內(nèi)可超過10 mg/mL。除了超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性外，還研究了BGCN清除羥基自由基(·OH)/DPPh·/ABTS+的抗氧化能力(圖2f-l)。當甲基紫(MB)與Fe2+/H2O2混合時，MB的吸收峰幾乎消失，這是由于MB被氧化成無色產(chǎn)物。如圖2f所示，PBS和SiO2基團沒有清除·OH，而在BGCN組中，MB的吸收強度隨著樣品濃度的增加而同步增加，這表明BGCN隨著濃度的變化而逐漸清除·OH。這些結(jié)果表明 BGCN 尤其是 BGCN@PDA 在緩解氧化應激、抗菌及促進傷口愈合方面具有巨大潛力。

圖2.類酶活性和抗氧化能力的評估。a）BGCN的超氧化物歧化酶活性機理圖；b)不同濃度的BGCN清除·O^2-的UV-Vis光譜；c)BGCN的·O2-清除率；d)BGCN的CAT活性機理圖；e)在1 mM H₂O₂存在下，不同濃度的BGCN產(chǎn)生O₂濃度；f)BGCN對·OH的清除能力；g)BGCN@PDA的DPPH·清除機理圖；h)不同濃度BGCN@PDA清除DPPH·的UV-Vis光譜；i) BGCN@PDA的DPPH·清除；j)BGCN@PDA的ABTS⁺清除機理圖；k)不同濃度的BGCN@PDA對ABTS⁺清除作用的UV-Vis光譜；l)BGCN@PDA的ABTS+清除率

（3）光熱抗菌性能

考慮到聚多巴胺具有優(yōu)異的光熱性能，該研究測試了BGCN@PDA在808 nm(1.0W·cm^?2，10min)激光照射下的光熱轉(zhuǎn)換性能，如圖3a所示,在整個激光照射過程中，SiO2和BGCN的溫度沒有變化，但BGCN@PDA的溫度隨著照射時間的增加而升高到50℃以上，其最高溫度隨著BGCN@PDA濃度的增加而增加(圖3b)。隨后，該研究選擇了0.5 mg/mL的濃度來測試BGCN@PDA的光熱穩(wěn)定性。這對BGCN@PDA作為光熱抗菌劑的應用至關重要。圖3c五次光熱循環(huán)實驗進一步證實了BGCN@PDA的光熱穩(wěn)定性。這些結(jié)果證實了BGCN@PDA具有良好的光熱容量和光熱穩(wěn)定性。為了進一步研究BGCN@pda在不同光照條件下的殺菌能力，以SiO₂和BGCN為對照，在1.0w·cm^?2下進行了抗菌性能測試，結(jié)果如圖3d-f所示。PBS組和其他組(SiO₂、BGCN、BGCN@PDA)細菌菌落明顯，而BGCN@PDA+NIR組細菌數(shù)量最多。

圖3 BGCN@PDA的光熱效應和光熱抗菌性能。a)不同樣品的光熱容量；b)溫度曲線c)BGCN@PDA(0.5 mg/mL)的光熱循環(huán)穩(wěn)定性。不同標本處理后細菌菌落分布圖： d)MRSA、e)金黃色葡萄球菌、f)大腸桿菌；g~i)各組別的抗菌率

（4）BGCN@PDA的細胞相容性、血液相容性和細胞遷移分析

分別使用三種細胞系L929、RAW264.7和HUVECs評估了BGCN和BGCN@PDA的細胞相容性(圖4a-c)。與細胞共培養(yǎng)24h后，200 μg/mL BGCN對L92 9和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的活力無明顯影響，但對RAW2 6 4.7細胞有輕微的細胞毒作用。相反，濃度為20 0 μg/mL BGCN@PDA不僅對三種細胞無毒，而且具有一定的促增殖作用，提示對BGCN進行表面修飾是非常必要的。用紅細胞研究了BGCN和BGCN@PDA的血液相容性(圖4d)結(jié)果表明，PBS組、SiO2組、BGCN組和BGCN@PDA組紅細胞無色透明，而陰性對照Triton X100組紅細胞破裂。值得注意的是，高濃度(200 μg/mL)的BGCN(溶血和GT；5%)超出了安全范圍。BGCN@PDA在濃度為200μg/mL時不存在上述問題，說明PDA不僅提高了BGCN的細胞相容性，而且對BGCN的血液相容性也有很大的貢獻。成纖維細胞是結(jié)締組織中最重要的細胞，其增殖和遷移為創(chuàng)面的填充和表皮細胞的覆蓋創(chuàng)造了條件。利用L929進行了劃痕實驗，以探索BGCN@PDA是否具有促進細胞遷移的特性。如圖4e示，共培養(yǎng)24 ，各組之間沒有差異。48h后，Ctrl組、SiO2組、BGCN組和BGCN@PDA組的遷移率分別為53.69%、55.19%、78.46%和75.72%。此時，BGCN@PDA和Ctrl組之間已經(jīng)有了顯著的差異。結(jié)果提示，BGCN@PDA能顯著促進L929細胞的遷移，并在創(chuàng)面修復的增殖期發(fā)揮積極作用。

圖4 BGCN@PDA的細胞相容性和細胞遷移。a -c)BGCN@PDA對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(a)、L929細胞(cb)、RAW264.7細胞(c的細胞相容性；d)不同樣本的血液相容性；e)L929細胞在不同時間段的劃痕代表性圖像

（5）抗炎和巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化

在傷口修復中，過度的炎癥不僅使傷口難以愈合，還會導致各種惡性疾病的并發(fā)癥。使用內(nèi)毒素刺激的巨噬細胞來研究BGCN@PDA在基因水平上對促炎因子表達的影響(圖5a~b)。與對照組相比，內(nèi)毒素治療組大鼠肺組織中IL-6和TNF-α的表達增加。經(jīng)BGCN@PDA共同孵育后，IL-6和腫瘤壞死因子-α的表達顯著降低。此外，二氧化硅還具有抗炎活性，這是通過偏硅酸鹽離子(SiO₂^-)的增溶實現(xiàn)的。這些結(jié)果表明，BGCN@PDA有望促進傷口從炎癥階段向下一階段的過渡。為了進一步探討該物質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)中的抗炎機制，檢測了巨噬細胞的表型轉(zhuǎn)化。巨噬細胞根據(jù)周圍微環(huán)境的不同表現(xiàn)出不同的功能表型(M1/M2)。其中，M1巨噬細胞與促進炎癥反應有關，而M2巨噬細胞與免疫調(diào)節(jié)和減輕炎癥密切相關。因此，利用脂多糖誘導M1巨噬細胞活化后，對M1巨噬細胞特征標記的CD86進行流式細胞術分析(圖5c)。結(jié)果表明BGCN組M1表型巨噬細胞數(shù)(55.97%)較內(nèi)毒素組(62.88%)有所減少，但BGCN+PDA組減少更為明顯(53.21%)。免疫熒光染色觀察BGCN@PDA對巨噬細胞重編程的影響。結(jié)果顯示，內(nèi)毒素組巨噬細胞呈大量高強度紅色熒光，CD86陽性細胞數(shù)較多，提示內(nèi)毒素組巨噬細胞主要呈M1型，而BGCN組和BGCN+PDA組的紅色熒光強度明顯減弱，表明兩組M1型巨噬細胞明顯減少。圖5d的CD206對M2型巨噬細胞的染色顯示，BGCN@PDA組出現(xiàn)更明顯的綠色熒光提示本組巨噬細胞主要表現(xiàn)為M2表型。以上結(jié)果提示，BGCN@PDA可促進巨噬細胞由M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化，從而減少促炎因子的釋放，達到減輕炎癥的效果。

圖5 .巨噬細胞炎癥相關基因表達及表型分析。a）IL-6和b)TNF -α在不同處理中的表達；c)不同處理后巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化的流式細胞術分析；d)不同處理后巨噬細胞表型的免疫熒光染色

（6）細胞內(nèi)抗氧化活性和氧的產(chǎn)生

感染傷口中的免疫反應紊亂會導致過量的ROS產(chǎn)生，進一步加劇局部組織損傷，導致持續(xù)的慢性炎癥。進一步評估了BGCN@PDA在清除細胞內(nèi)ROS方面的作用（圖6a）。在LPS處理后，大量的ROS RAW264.7細胞產(chǎn)生綠色熒光，而BGCN組處理后，ROS含量明顯降低，BGCN@PDA組的ROS甚至幾乎完全消除，表明BGCN @ PDA具有良好的抑制細胞內(nèi)ROS的能力，在體內(nèi)平衡氧化應激和治療炎癥相關疾病方面具有潛在的應用價值。一定量的氧氣有助于改善組織代謝，抑制厭氧菌的生長，減輕疼痛。圖6b使用[Ru（dpp）3] Cl₂氧指示探針來檢測分子氧的產(chǎn)生在將探針與L929細胞共孵育后，與對照組相比，BGCN組和BGCN@PDA的紅色熒光顯著減少，這是由于動態(tài)爆發(fā)效應，分子氧的存在使[Ru（dpp）₃]Cl₂的發(fā)光強度降低，說明BGCN@PDA具有一定的產(chǎn)氧能力。

圖6 胞內(nèi)ROS的清除和胞內(nèi)氧氣的產(chǎn)生。a)DCFH-DA檢測不同樣品處理后RAW 264.7細胞中ROS清除的熒光圖像；b)[Ru(Dpp)3]Cl2檢測不同樣品處理后L929細胞中的氧產(chǎn)生圖像

（7）MRSA感染傷口治療

基于BGCN@PDA優(yōu)異的抗感染和氧化應激調(diào)節(jié)能力，使用耐藥菌感染傷口的小鼠作為模型來研究BGCN@PDA用于組織修復的治療效果。圖7a顯示了在特定時間點不同治療組對MRSA感染傷口修復的影響。在第3天，SiO₂，與對照組相比，BGCN和BGCN@PDA組能夠加速傷口閉合，但同時出現(xiàn)大量黃色膿液，這是由于嚴重的細菌感染。相反，BGCN@PDA + NIR組顯著加速了傷口閉合并解決了感染。在第7天，與其他組相比，BGCN和BGCN@PDA組的傷口面積顯著減小，并且BGCN@PDA + NIR組的傷口愈合率已經(jīng)高達76.7%（圖7 b~c）。為了進一步考察BGCN@PDA + NIR組在體內(nèi)治療過程中的抗感染能力，從各組的創(chuàng)傷傷口中收集細菌，結(jié)果如圖7e所示，在第3天，對照組、SiO₂組、BGCN組和BGCN@PDA組有大量的細菌菌落，而BGCN@PDA + NIR在光熱抗菌作用下能有效防止創(chuàng)面細菌感染，表現(xiàn)出較好的早期抗感染能力，第7天，對照組和SiO₂組的菌落數(shù)最高，而BGCN@PDA + NIR組未發(fā)現(xiàn)菌落，抑菌率達99%接著，通過蘇木精-伊紅（H&E）染色評估不同處理對感染傷口的組織學愈合過程的影響。如圖7f所示，在第3天，對照組和SiO2組尚未形成表皮層，而BGCN@PDA +近紅外組已形成完整的表皮層，隨著時間的延長，各組間差異越來越明顯，第14天，對照組和SiO₂組的創(chuàng)面仍處于愈合階段，而BGCN@PDA + NIR組不僅實現(xiàn)了上皮化，皮膚結(jié)構(gòu)基本完整，而且產(chǎn)生了許多毛囊和皮膚附屬物，進一步證實了BGCN@PDA對感染皮膚的良好治療效果。

圖7 BGCN@PDA體內(nèi)感染創(chuàng)面修復與再生。a）感染創(chuàng)面在0、3、7和14天不同處理后修復的代表性圖像；b)各組傷口愈合率的定量統(tǒng)計；c) 不同組傷后0~14天創(chuàng)面愈合情況圖；d)第3天和第7天的抗感染效果照片；e)第3天和第7天的抗菌率定量統(tǒng)計；f)第3天和第14天各組創(chuàng)面組織的HE染色

為了驗證BGCN@PDA對傷口炎癥階段的治療效果，以促炎細胞因子IL-6和TNF-α的表達水平來評估不同治療后皮膚組織中的炎癥程度（圖8a~b）。IL-6和TNF-α的陽性信號在對照組和SiO₂組中表達最清楚，半定量統(tǒng)計結(jié)果甚至顯示BGCN@PDA + NIR組的炎癥信號比對照組減少了40%以上，BGCN和BGCN@PDA的炎癥信號也明顯減少。新生血管的數(shù)量是傷口修復的重要指標，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管生長的促進劑，在血管生成和傷口愈合中起著重要作用。因此，在第7天通過VEGF免疫組化染色評價樣品的血管生成作用（圖8 c）BGCN@PDA + NIR組中棕色陽性信號的表達顯著高于其他組，提示BGCN@PDA + NIR組具有促進血管生成的作用，這主要是由于炎癥期的順利通過，相反，盡管SiO₂具有良好的促血管生成作用，但目前仍無法發(fā)揮其價值，這些結(jié)果提示BGCN@PDA作為納米粉末敷料，比單一的抗菌劑、抗真菌劑或促血管生成劑表現(xiàn)得更好，并且可以在傷口修復的多個階段發(fā)揮不同程度的積極作用。另外，用Masson染色觀察在傷口愈合期間膠原纖維的形成情況。圖8d中膠原纖維（藍色）在BGCN@PDA + NIR組中分布最廣泛，表明該組中的膠原纖維含量在第14天最豐富。提示BGCN@PDA能有效促進創(chuàng)面修復過程中膠原纖維的形成。

圖8 創(chuàng)面組織進行免疫組織化學染色和Masson染色。a)治療3d后創(chuàng)面的TNF-α染色圖像；b)IL-6染色的創(chuàng)面圖像；c)治療7d后創(chuàng)面的血管內(nèi)皮生長因子染色圖像；d)不同處理后第14天的Masson染色分析感染創(chuàng)面在0、3、7和14天不同處理后修復的代表性圖像