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圖1 不同敷料多孔結(jié)構(gòu)的表征。（a）不同冷凍速率下冰模板法制備 ACol 的示意圖；（b）具有排列通道或隨機(jī)孔隙的膠原敷料的矢狀面和橫斷面SEM 圖像，紅色雙向箭頭指示通道寬度；（c）不同多孔結(jié)構(gòu)敷料的孔隙率；（d）不同多孔結(jié)構(gòu)敷料的通道寬度或孔徑大小

（2）ACol的吸液行為

使用藍(lán)墨水對(duì)比五種不同多孔結(jié)構(gòu)膠原敷料的吸收行為（圖 2A）。藍(lán)墨水高度隨通道寬度增加而升高，ACol 中的液位高于隨機(jī)孔隙敷料（圖 2B），通道最寬（約 120μm）的 ACol 吸收速度最快。這些結(jié)果表明，排列通道結(jié)構(gòu)通過毛細(xì)作用有效提高液體吸收速度。毛細(xì)作用中，排列通道內(nèi)液體吸收高度 h 與時(shí)間 t 的關(guān)系為 h2 =（πrγcosθ）/（2η）t（r 為通道半徑，γ 為表面張力，η 為液體密度，θ 為液體與管道的接觸角），由于 “γ”“η”“θ” 為液體固有屬性及與膠原的接觸角，是恒定值，因此同一時(shí)間內(nèi)液位高度與排列通道半徑呈正相關(guān)。ACol 具有類樹結(jié)構(gòu)，其排列通道的曲折度低于隨機(jī)孔隙膠原敷料，這些排列通道促進(jìn)毛細(xì)作用，有助于提升 ACol 的液體吸收能力（圖 2D）。此外，將多種敷料浸入液體，24 小時(shí)完全飽和后計(jì)算最大吸液量與基面積的比值，結(jié)果顯示改進(jìn)后的 ACol 最大吸液量仍低于 0.34g/cm2（重度燒傷 24 小時(shí)的滲出液量），表明單獨(dú) ACol 不足以滿足臨床需求（圖 2C），需進(jìn)一步改進(jìn)以提高其最大吸液能力。

圖2 不同多孔結(jié)構(gòu)敷料的吸液行為表征。（a）連續(xù)光學(xué)圖像顯示不同多孔結(jié)構(gòu)敷料的吸液行為；（b）吸收的藍(lán)墨水高度隨時(shí)間變化，實(shí)線為擬合曲線；（c）不同敷料的最終吸收容量；（d）排列通道敷料與隨機(jī)孔隙敷料的示意圖對(duì)比

（3）具有定向通道的低溫膠原（Cryo - ACol）的表征

樹木高效吸水得益于樹干中具有排列通道的分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞腔中的互連孔隙，而通過冷凍交聯(lián)制備的低溫凝膠在微米范圍內(nèi)具有孔隙互連性。因此，ACol 經(jīng)冷凍交聯(lián)改性得到同時(shí)具備排列通道和互連孔隙的 Cryo-ACol（圖 3A）。通道寬度為 120μm的 ACol 液體引流速度最快，被選用于后續(xù)研究?？v向截面的代表性 SEM 圖像顯示，Cryo-ACol 的通道壁上存在互連孔隙（圖 3B）。Cryo-ACol 的液體吸收效率顯著提高（圖 3C、D），其吸收容量（0.53±0.01g/cm2）幾乎是 ACol（0.26±0.01g/cm2）的兩倍，足以滿足重度燒傷患者的滲出液吸收需求（圖 3E）。

圖3 Cryo-ACol 的表征。（a）受樹木分級(jí)結(jié)構(gòu)啟發(fā)，將單向冰模板法與冷凍交聯(lián)結(jié)合制備具有排列通道和互連孔隙的膠原敷料（Cryo-ACol）的示意圖；（b）Cryo-ACol 和 ACol 的矢狀面 SEM 圖像；（c）連續(xù)光學(xué)圖像顯示 Cryo-ACol 和 ACol 的吸液行為，以藍(lán)墨水為示例；（d）吸收的藍(lán)墨水高度隨時(shí)間變化；（e）Cryo-ACol 和 ACol 的最終吸收容量

（4）用DNA對(duì)功能化冷凍脫細(xì)胞羊膜膠原蛋白（DNA - Cryo - ACol）進(jìn)行表征

除滲液管理外，燒傷創(chuàng)面再生還需要免疫細(xì)胞的及時(shí)動(dòng)員。為使膠原敷料具備免疫調(diào)節(jié)特性，利用EDC和NHS對(duì)Cryo-ACol進(jìn)行DNA功能化修飾，最終形成DNA-Cryo-ACol（圖4A）。掃描電子顯微鏡圖像顯示膠原敷料表面存在DNA功能化修飾（圖4B右側(cè)圖像），且該修飾未改變排列通道和互連孔隙的結(jié)構(gòu)（圖4B左側(cè)圖像）。磷是DNA的特征元素，通過能量色散X射線分析（EDAX）和X射線光電子能譜（XPS）檢測(cè)DNA-Cryo-ACol中磷的相對(duì)含量（圖4C、D），發(fā)現(xiàn)隨著DNA溶液濃度從0.25 mg/mL增至2 mg/mL，磷含量也隨之增加。免疫熒光圖像顯示膠原（COL-1抗體，紅色）與DNA（核酸染料，綠色）共標(biāo)記（圖4E），初步表明DNA結(jié)合于膠原表面。衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）檢測(cè)顯示，在1143–1213 cm?1和950–1068 cm?1處出現(xiàn)強(qiáng)峰，分別代表P-O-P鍵和P-N-C鍵（圖4F）。通過綠色熒光強(qiáng)度（圖4E）和甲基綠吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定DNA含量，結(jié)果顯示DNA含量隨DNA溶液濃度升高而增加（圖4G）。與Cryo-ACol相比，DNA功能化修飾未改變吸液行為（圖4H），DNA-Cryo-ACol的引流速度約為64.52 μL/s，吸收容量約為0.53 g/cm2。

圖4 DNA-Cryo-ACol 的表征。（a）DNA-Cryo-ACol 的合成示意圖；（b）DNA-Cryo-ACol 和 Cryo-ACol 的矢狀面 SEM 圖像；（c）不同 DNA 溶液濃度制備的 DNA-Cryo-ACol 的 EDAX 元素分析；（d）不同 DNA 溶液濃度制備的 DNA-Cryo-ACol 的 XPS survey 光譜，（e）DNA-Cryo-ACol 的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像；（f）不同 DNA 溶液濃度制備的 DNA-Cryo-ACol 的 ATR-FTIR 光譜；（g）（i）E 中 DNA 熒光強(qiáng)度的定量分析，（ii）通過甲基綠吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定的 DNA-Cryo-ACol 的 DNA 含量；（h）DNA-Cryo-ACol 的吸收速度和容量）

（5）DNA-低溫脫細(xì)胞膠原中滲出液的管理

利用離體模型進(jìn)一步評(píng)估膠原敷料的吸液特性，將不同多孔結(jié)構(gòu)的膠原敷料置于涂抹了藍(lán)墨水的豬皮上（圖5A）。從頂部觀察，隨機(jī)孔隙敷料從中心向邊緣吸收墨水（圖5B(i)粉色三角形），而排列通道敷料則從邊緣向中心吸收墨水（圖5B(ii-iv)綠色三角形）。不同敷料的吸收能力存在差異，與Cryo-ACol或DNA-Cryo-ACol相比，商用敷料和ACol處理的豬皮上殘留液體更多，豬皮表面的顏色深度反映了這一結(jié)果（圖5B最右列）；且商用敷料組相比其他組出現(xiàn)明顯浸漬（圖5B(i)黃色箭頭）。

由于頂部視圖無法觀察敷料內(nèi)部液體流動(dòng)，且藍(lán)墨水不能完全模擬重度燒傷滲出液的黏度和密度，故采用有限元模擬重度燒傷滲出液（黏度1.9 mPa·s，密度1.03 g/cm3）以評(píng)估敷料的滲液管理效果（圖5C、D）?？v向截面模型中，商用敷料內(nèi)的滲出液流速在初始時(shí)呈各向同性，隨時(shí)間推移，中心流速快于邊緣（圖5C）；而DNA-Cryo-ACol中邊緣流速快于中心，且該現(xiàn)象隨時(shí)間更明顯（圖5D），模擬結(jié)果與離體模型一致，表明排列通道敷料抑制滲出液浸漬的能力源于滲出液流速在徑向的不均勻分布。利用在體模型進(jìn)一步檢驗(yàn)DNA-Cryo-ACol對(duì)滲出液的吸收效果（圖5A），結(jié)果顯示商用膠原敷料導(dǎo)致熒光標(biāo)記滲出液殘留和浸漬（圖5E白色三角形和白色虛線），ACol也存在滲出液殘留（圖5E白色三角形），而Cryo-ACol和DNA-Cryo-ACol無此現(xiàn)象。

圖5 DNA-Cryo-ACol的滲液管理特性。（a）實(shí)驗(yàn)方法示意圖；（b）連續(xù)光學(xué)圖像觀察不同敷料在豬皮上吸收一滴藍(lán)墨水的吸收特性；（c）和（d）有限元模擬顯示液體在商用膠原敷料和DNA-Cryo-ACol敷料模型中的吸收情況；（e）敷料處理前后在紫外光下拍攝的創(chuàng)面圖像

（6）DNA低溫脫細(xì)胞膠原的免疫調(diào)節(jié)特性

為探究DNA-Cryo-ACol的免疫調(diào)節(jié)潛力，用其處理燒傷創(chuàng)面，于第7天采集創(chuàng)面樣本進(jìn)行 bulk RNA測(cè)序，以Cryo-ACol處理的創(chuàng)面組織為對(duì)照。差異基因分析顯示，Cryo-ACol與DNA-Cryo-ACol處理組的轉(zhuǎn)錄組譜存在顯著差異（圖6A）；京都基因與基因組百科全書富集分析表明，差異基因主要集中在免疫系統(tǒng)（圖6B）；基因本體論分析顯示，DNA-Cryo-ACol誘導(dǎo)與T細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的基因上調(diào)，尤其是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答（圖6C、D(i)）。

與CD4+T細(xì)胞發(fā)育、分化和功能相關(guān)的差異基因如圖6D(ii)所示，RNA測(cè)序結(jié)果提示DNA-Cryo-ACol組中CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加。免疫熒光染色顯示，Cryo-ACol募集的CD4+T細(xì)胞較少，而DNA-Cryo-ACol處理組中CD4+T細(xì)胞大量聚集（圖6E、F）。

RNA序列的基因集富集分析顯示，胞質(zhì)DNA感應(yīng)通路上調(diào)，其中Toll樣受體9（TLR9）級(jí)聯(lián)反應(yīng)上調(diào)最顯著（圖6G）。TLR9作為DNA傳感器可識(shí)別DNA中的未甲基化CpG基序，其免疫應(yīng)答與釋放的CpG基序濃度密切相關(guān)。因DNA的免疫調(diào)節(jié)作用僅依賴CpG基序，選擇含多個(gè)高密度CpG區(qū)域的全長(zhǎng)小牛胸腺雙鏈DNA以最大化免疫調(diào)節(jié)效果。TLR9與DNA的識(shí)別通過髓系分化初級(jí)反應(yīng)蛋白88（MyD88）激活下游信號(hào)，將CD4+T細(xì)胞與真皮外植體共培養(yǎng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNA-Cryo-ACol組中TLR9和MyD88的表達(dá)上調(diào)（圖6H），提示其通過TLR9/MyD88信號(hào)通路調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞行為（圖6I）。

為評(píng)估DNA-Cryo-ACol在減少瘢痕形成中的潛在免疫調(diào)節(jié)功效，檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中與皮膚瘢痕相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)顯示其促進(jìn)多種瘢痕相關(guān)抑制因子的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-10（IL-10）和干擾素-γ（IFN-γ）（圖6J），其中IL-10分泌增加最顯著。

將活化的成纖維細(xì)胞與不同敷料或經(jīng)DNA-Cryo-ACol/膠原敷料趨化的遷移CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示CD4+T細(xì)胞通過抑制活化成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)，賦予DNA-Cryo-ACol抗瘢痕效果（圖6K）。綜上，DNA-Cryo-ACol的免疫調(diào)節(jié)特性是其在體外發(fā)揮瘢痕抑制作用的必要條件。

圖6 DNA-Cryo-ACol的免疫調(diào)節(jié)特性及其免疫調(diào)節(jié)能力對(duì)體外瘢痕形成的影響。（a）對(duì)照組與DNA-Cryo-ACol組的差異基因熱圖；（b）差異表達(dá)基因的京都基因與基因組百科全書功能分類；（c）基因本體論分析顯示DNA-Cryo-ACol對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的正向調(diào)節(jié)；（d）DNA-Cryo-ACol的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的基因本體論分析和熱圖；（e）小鼠燒傷創(chuàng)面對(duì)照組或DNA-Cryo-ACol組中DAPI、CD4的共聚焦免疫熒光成像代表性示例；（f）不同組中CD4/DAPI熒光強(qiáng)度的定量分析；（g）基因集富集分析顯示DNA-Cryo-ACol的胞質(zhì)DNA感應(yīng)通路和TLR9通路上調(diào)；（h）TLR9和MyD88表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析；（i）DNA-Cryo-ACol調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞機(jī)制的示意圖；（j）細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果；（k）檢測(cè)成纖維細(xì)胞活化抑制的α-SMA示意圖和共聚焦免疫熒光圖像

（7）DNA低溫海藻酸鈣（DNA?Cryo?ACol）對(duì)體內(nèi)燒傷創(chuàng)面愈合的影響

在大鼠背部制備深二度燒傷創(chuàng)面，以商用膠原敷料為對(duì)照，檢測(cè)DNA-Cryo-ACol敷料的體內(nèi)效果，于0、3、7、14、21天對(duì)每個(gè)燒傷創(chuàng)面進(jìn)行拍照（圖7A）。結(jié)果顯示，DNA-Cryo-ACol處理的創(chuàng)面閉合率高于商用膠原敷料處理的創(chuàng)面（圖7B粉色虛線、圖7D(i)）。H&E和Masson三色染色表明，至21天，DNA-Cryo-ACol可促進(jìn)毛囊再生（圖7C黃色星號(hào)、圖7D(ii)）并形成“籃狀”膠原網(wǎng)絡(luò)（圖7C紅色箭頭）；而商用膠原敷料處理的組織在21天出現(xiàn)明顯的平行排列細(xì)胞外基質(zhì)纖維（圖7C黑色箭頭），且毛囊再生較少。天狼星紅染色顯示，21天時(shí)DNA-Cryo-ACol處理的愈合燒傷創(chuàng)面中Ⅰ型膠原（黃色）和Ⅲ型膠原（綠色）的比例為2:1，與未受傷皮膚相當(dāng)（圖7D(iii)）。

與Cryo-ACol和DNA修飾的商用膠原相比，DNA-Cryo-ACol處理的樣本毛囊再生更好，膠原成分比例恢復(fù)更佳（圖7B綠色虛線、圖7C、圖7D），實(shí)現(xiàn)了燒傷創(chuàng)面的無瘢痕愈合，其排列通道的結(jié)構(gòu)特征和DNA功能化帶來的免疫調(diào)節(jié)作用被認(rèn)為有助于此過程。

此外，具有排列通道的敷料（DNA-Cryo-ACol和Cryo-ACol）減少了濕性皮炎的面積（圖7B藍(lán)色箭頭、圖7D(i)第3天創(chuàng)面面積），這一結(jié)果體現(xiàn)了DNA-Cryo-ACol的體內(nèi)滲液管理特性。

圖7 DNA-Cryo-ACol敷料促進(jìn)燒傷創(chuàng)面皮膚再生的表征。（a）測(cè)試不同敷料治療效果的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示意圖；（b）3、5、7、14天的殘留創(chuàng)面面積和21天的瘢痕面積及創(chuàng)面閉合軌跡圖；（c）21天愈合燒傷創(chuàng)面的代表性H&E圖像、Masson圖像和天狼星紅染色圖像；（d）（i）創(chuàng)面閉合和濕性皮炎分析，（ii）毛囊的組織學(xué)定量，（iii）21天膠原Ⅰ/Ⅲ比值的定量

（8）CD4 + T細(xì)胞對(duì)DNA -冷凍 - ACol誘導(dǎo)的無瘢痕皮膚愈合的影響

體外數(shù)據(jù)表明DNA-Cryo-ACol敷料可通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞行為抑制促纖維化肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。為在體內(nèi)驗(yàn)證該假設(shè)，用DNA-Cryo-ACol或Cryo-ACol膠原敷料（對(duì)照）處理大鼠燒傷創(chuàng)面，于處理后7天和21天采集樣本。結(jié)果顯示，DNA-Cryo-ACol處理的樣本中存在明顯的CD4+IL-10+T細(xì)胞區(qū)域（圖8A、B）；且該組在7天和21天時(shí)α-SMA的表達(dá)顯著降低，與正常未受傷皮膚的表達(dá)水平相近（圖8C、D）。這些初步體內(nèi)結(jié)果證實(shí)，DNA-Cryo-ACol敷料應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面可調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的富集及免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)降低瘢痕相關(guān)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。

為探究CD4+T細(xì)胞在DNA-Cryo-ACol誘導(dǎo)的無瘢痕皮膚愈合中的作用，在注射抗CD4抗體的CD4+T細(xì)胞耗竭C57BL/6J小鼠和注射同型對(duì)照抗體的C57BL/6J小鼠中重復(fù)傷口愈合實(shí)驗(yàn)，并在DNA-Cryo-ACol處理后28天檢查傷口愈合效果。結(jié)果顯示，DNA-Cryo-ACol處理的C57BL/6J小鼠傷口閉合速度更快，且有大量毛發(fā)生長(zhǎng)（圖8F、G），因傷口上長(zhǎng)出的毛發(fā)，這些傷口難以通過視覺識(shí)別；而CD4+T細(xì)胞耗竭的C57BL/6J小鼠經(jīng)DNA-Cryo-ACol處理的傷口出現(xiàn)無毛發(fā)的不規(guī)則瘢痕（圖8F白色虛線范圍），且傷口閉合速度較慢（圖8G）。CD4+T細(xì)胞耗竭組經(jīng)DNA-Cryo-ACol處理后的瘢痕面積顯著增加，達(dá)到原始傷口面積的12.67%。DNA-Cryo-ACol處理后28天，H&E和Masson三色染色顯示，在未耗竭CD4+T細(xì)胞的小鼠中，DNA-Cryo-ACol可顯著促進(jìn)毛囊再生（圖8I綠色箭頭）并形成籃狀膠原網(wǎng)絡(luò)（圖8I紅色箭頭）；相反，CD4+T細(xì)胞耗竭后，愈合的皮膚出現(xiàn)無毛發(fā)瘢痕，且膠原束呈水平排列（圖8I黑色箭頭）。這些研究證實(shí)，DNA-Cryo-ACol敷料促進(jìn)皮膚再生需要CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

圖8 DNA-Cryo-ACol通過募集CD4+T細(xì)胞和免疫應(yīng)答促進(jìn)皮膚再生的表征。（a）經(jīng)Cryo-ACol和DNA-Cryo-ACol處理的大鼠燒傷創(chuàng)面中CD4（紅色）、IL-10（綠色）和DAPI（藍(lán)色）的代表性共聚焦免疫熒光圖像；（b）不同組中CD4和IL-10的熒光強(qiáng)度定量分析；（c）經(jīng)Cryo-ACol和DNA-Cryo-ACol處理的大鼠燒傷創(chuàng)面中α-SMA的代表性共聚焦免疫熒光圖像；（d）不同時(shí)間點(diǎn)不同組中α-SMA的熒光強(qiáng)度定量分析；（e）評(píng)估在注射同型對(duì)照抗體和抗CD4抗體的小鼠中DNA-Cryo-ACol介導(dǎo)的燒傷創(chuàng)面愈合的手術(shù)流程；（f）0、7、14、28天的殘留創(chuàng)面面積；（g）7和14天殘留創(chuàng)面的相應(yīng)分析；（h）28天瘢痕面積分析；（i）代表性H&E圖像和Masson圖像；（j）毛囊的組織學(xué)定量