亚洲强入中文字幕乱码_国产剧爱丫爱丫免费观看_成人激情视频网_4480yy私人影院亚洲_有码+日韩+在线观看_美女任你摸在线视频网站_中文字幕日韩精品内射_亚洲sss777无码整片在线播放_中文字幕2019永久免费视频_男生插曲女生app下载迷你世界

研究示意圖

（1）Ir1的合成、表征及與銅的結合性能

通過多峰光譜分析系統(tǒng)地研究了Ir1與 Cu(II)/ Cu (I)的結合特性(圖 1A )。在用 CuCl₂滴定過程中， Ir1的紫外/可見吸收光譜呈現(xiàn)出漸進性變化。在加入 1.0 eq的 Cu(II) 后，在 380 nm 處出現(xiàn)明顯拐點，證實了 1:1 的結合化學計量。Cu(II)滴定出現(xiàn)340 nm等吸光點，圖1B），。1H NMR中δ 12.709 ppm信號減弱（Δδ ≈ 0.015 ppm，圖1C）；對 Cu(II) 的不同光物理響應以濃度依賴性熒光猝滅為特征，而 Cu(I) 和 Zn(II) 的影響可忽略不計（圖 1D）。X 射線光電子能譜 (XPS) 分析提供了 Cu 氧化還原循環(huán)的直接證據(jù)：Cu 2p 3/2結合能從 934.8 eV（Cu(II)）轉移到 932.5 eV（Cu(I)），同時伴隨震動衛(wèi)星峰消失（圖 1E-G）。通過 X 射線吸收光譜 (XAS) 進一步闡明了 Ir1-Cu(II)和Ir1-Cu(I)配合物的配位結構。圖1H顯示了傅里葉變換的k3加權Cu K邊擴展 X 射線吸收精細結構 (EXAFS)，兩個配合物均出現(xiàn)了一個歸因于 Cu–O/N 鍵的顯著 1.50 ? 峰。值得注意的是，歸一化的 XANES 光譜（圖 1I ）顯示Ir1-Cu(II)比Ir1-Cu(I)具有更高的吸收邊能量，證實了Ir1-Cu(II)中銅價態(tài)的升高。Cu K邊光譜的小波變換 (WT) 分析（圖 1J-L）進一步驗證了不同的配位環(huán)境。

圖1 Ir1與銅離子的配位特性及GSH介導的還原。(A) Ir1的PDT模式切換示意圖。(B, C) UV-Vis和1H NMR滴定光譜。(E-G) XPS譜圖。(H, I) XANES和EXAFS譜圖

（2）Cu(II)配位和GSH還原誘導Ir1的II型向I型轉化

如圖2 A所示，在 Cu(II) 配位后，¹ O ₂生成顯著降低，猝滅比分別為 5.6 ( Ir1-Cu(II) ) 和 2.7 ( Ir1-Cu(I) )，而Ir1-Zn(II)保持了相當?shù)男?。而在通過二氫羅丹明123 (DHR123) 監(jiān)測的相同輻照條件下，Ir1-Cu(I)的超氧陰離子 (O₂^?-) 產(chǎn)量比游離Ir1增加了 1.3倍，表明 I型光動力活性增強，而Ir1-Cu(II) 的光動力活性則被抑制了 1.7倍（圖 2B）。以羥基苯基熒光素（HPF）為探針，Ir1-Cu(I)在可見光下高效生成?OH，而Ir1-Cu(II)完全抑制該過程；GSH將Ir1-Cu(II)還原為Ir1-Cu(I)后活性恢復，?OH產(chǎn)率較原始Ir1提升1.3倍（圖2C）。值得注意的是，525 nm 的光照射顯著加速了這一過程，Ir1-Cu(II)在光照后 3 分鐘內(nèi)就實現(xiàn)了 GSH 的快速消耗（圖 2D），這證明了Ir1-Cu(II)具有高效的光激活 GPx 樣酶活性。為了量化腫瘤相關 pH 條件下 ?OH 的產(chǎn)生，使用 3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 作為 H2O2活化的比色探針。如圖 2E所示，Ir1-Cu(II)表現(xiàn)出 pH 依賴性催化行為：在生理 pH 7.4 (PBS) 下，在光照下觀察到極少量的 ?OH 生成。值得注意的是，與中性 pH 相比，酸性條件（pH 6.6）使 ?OH 產(chǎn)生增加了 7.2 倍。利用紫外可見光譜研究了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的氧化動力學。在 525 nm 的光照下，Ir1-Cu(II)誘導了特征光譜偏移：339 nm 處的特征峰降低（表明 NADH 消耗），260 nm 處的光譜升高（反映 NAD? 的生成），證實Ir1-Cu(II)表現(xiàn)出 NADH 氧化酶樣活性，通過光控電子轉移促進 NADH→NAD? 的轉化（圖2F）。DFT計算顯示Cu(I)配位使S?→T?能隙由3.03 eV降至2.79 eV，增強自旋軌道耦合與系間竄越（圖2G）；電子順磁共振與理論分析表明，Ir1-Cu(II)開殼層D?態(tài)在光激發(fā)時面臨高能量壁壘，GSH誘導電子回配對后回歸閉殼層S₀，實現(xiàn)高效電荷分離（圖2H）?；谏鲜鼋Y果，提出Ir1通過 Cu 配位轉換和 GSH 響應還原機制動態(tài)調(diào)節(jié) I 型 ROS 生成（圖2H、I）。

圖2 Ir1在銅離子與GSH調(diào)控下的ROS生成模式切換。(A) ABDA探針顯示Cu(II)配位抑制了¹O₂（Type II）的生成。(B, C) DHR123和HPF探針顯示GSH還原后的Ir1-Cu(I)復合物高效生成O₂^??和?OH（Type I）。(D-F) DTNB光譜圖。(H, I) Type I ROS生成及協(xié)同代謝干擾機制示意圖

（3）Ir1@FA@MOFs的構建與表征

利用Ir1的光敏特性，通過Cu(II)-偶氮咪唑-Zn(II)配位開發(fā)了GSH消耗/缺氧適應性MOF平臺（圖3A）。Ir1@FA@MOFs的結構表征通過透射電子顯微鏡 (TEM) 揭示了明確的納米晶體形貌 (圖3B)，元素映射證實了 Ir、Cu、Zn、C、N、O 和 S 物質的均勻分布 (圖3C)。動態(tài)光散射 (DLS) 測量表明單分散納米顆粒的流體動力學直徑為 127.7 ± 0.6 nm (PDI = 0.113 ± 0.008)，水懸浮液中的 zeta 電位為 ?20.2 ± 1.0 mV (圖3D)。刺激響應分解研究揭示了 pH 依賴性降解（ pH 5.0 時Ir1釋放 48.6% 而在pH 7.4 時僅釋放6.3%）、ROS 引發(fā)的溶解加速（光照下Ir1釋放 29.5% 而在黑暗條件下僅釋放5.8%）和缺氧增強分解（有 Na₂S₂O₄（10 mM）時Ir1釋放29.2% 相比沒有 Na₂S₂O₄ 時僅釋放5.1%），證實了 TME 響應性藥物釋放曲線（圖3E-H）。

圖3 Ir1@FA@MOFs納米平臺的構建與表征。(A) 納米平臺構建示意圖。(B-D) TEM圖像、元素映射和DLS粒徑。(E-H) 在模擬TME條件（酸性、ROS、缺氧）下的藥物釋放曲線和TEM形貌變化

（4）Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療破壞MDA-MB-231細胞中的氧化還原平衡

基于先前的研究成果，證明了Cu(II)介導的從氧依賴性II型光動力途徑向耐缺氧I型光動力途徑的轉變，采用了三種互補的ROS檢測方法來量化Ir1@FA@MOFs的藥效動力學作用。Ir1@FA@MOFs在光照下表現(xiàn)出劑量依賴性的ROS生成。在缺氧條件下也觀察到顯著的ROS生成，表明其具有雙氧適應性（圖4A-B）。使用?OH選擇性HPF和O₂^?–靶向二氫乙錠 (DHE) 探針實現(xiàn)了ROS種類特異性的時空分辨率。共聚焦顯微鏡證實了?OH和O₂^?–的升高（圖4C、E）。流式細胞術定量分析顯示在常氧條件下?OH和O₂^?–分別增加了1.5倍和1.6倍，在缺氧條件下分別增加了1.4倍和2.0倍（圖4D-F）。證明了Ir1@FA@MOFs的雙途徑機制：1）Cu(II)通過配體-金屬電荷轉移和芬頓反應增強I/II型ROS的生成；2）硫醇耗竭介導的抗氧化防御抑制。這種組合策略有效地破壞了氧化還原穩(wěn)態(tài)，同時減輕了缺氧誘導的光動力治療（PDT）耐藥性。

圖4 Ir1@FA@MOFs在缺氧細胞中誘導Type I ROS的生成。(A-F) 共聚焦熒光成像和流式細胞術

（5）Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療（PDT）誘導銅死亡、鐵死亡和PAN凋亡

TEM 分析表明，在缺氧條件下，Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 在 MDA-MB-231 細胞中引起明顯的線粒體腫脹和細胞質空泡化（圖5A）。在缺氧條件下，5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑并羰花青碘化物 (JC-1) 染色和流式細胞術分析顯示，在接受 PDT 治療的細胞中，線粒體幾乎完全去極化（94.7% 的細胞ΔΨ_m塌陷，而對照組為 0.3%），并伴有細胞腫脹（圖5B-D）。為了闡明Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療（PDT）的潛在機制，采用了細胞死亡特異性阻斷劑，包括銅死亡（四硫鉬酸銨；ATTM）、鐵死亡（Ferrostatin-1；Fer-1）、壞死性凋亡（Necrostatin-1；Nec-1）、焦亡（Necrosulfonamide；NSA）、凋亡（Z-VAD-FMK）和自噬（3-甲基腺嘌呤；3-MA）的抑制劑。在缺氧條件下，細胞活力挽救效率依次為：ATTM > Fer-1 > Nec-1 > NSA > Z-VAD-FMK，其中3-MA的作用可忽略不計。常氧條件下的反應也呈現(xiàn)出類似的趨勢（圖5E）。此外，缺氧條件下的蛋白質印跡分析量化了關鍵的生物標志物，包括銅死亡中鐵氧還蛋白 1（FDX1）的減少和二氫硫辛酰胺 s-乙酰轉移酶（DLAT；脂?；笖?shù)）的降低（圖5F），鐵死亡標志物谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）表達降低（圖5G）；壞死性凋亡關鍵蛋白 MLKL（Ser358）磷酸化水平升高（圖5H）；焦亡執(zhí)行蛋白 GSDMD-NT（31 kDa）剪切片段增加（圖5I）；凋亡效應分子 Caspase-3（17/19 kDa）活化上調(diào)（圖5J）。上述結果表明，Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 通過在常氧和缺氧條件下協(xié)同激活多種細胞死亡途徑來誘導銅死亡、鐵死亡和PAN死亡。

圖5 Ir1@FA@MOFs-PDT協(xié)同誘導多模式程序性細胞死亡。(A) 透射電鏡圖像 (B, C) JC-1染色。(D) 共聚焦顯微鏡圖。(E) 多種RCD抑制劑實驗顯示，銅死亡抑制劑(ATTM)和鐵死亡抑制劑(Fer-1)等能顯著挽救細胞活性。(F-J) Western Blot實驗。（K）Ir1 @ FA @ MOFs在光照下導致多模態(tài)細胞死亡的作用機制示意圖

（6）Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療（PDT）誘導ICD

共聚焦顯微鏡、流式細胞術和蛋白質印跡分析表明，Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 在常氧和缺氧條件下均誘導劑量依賴性 DAMP 調(diào)節(jié)（圖6A-E）。在缺氧條件下，Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 引起 HMGB1 易位（與未處理的對照組相比，核 HMGB1 減少 0.37 倍）、CRT 暴露（表面 CRT 水平增加 1.2 倍）和 ATP 分泌（缺氧條件下細胞外 ATP 升高 2.5 倍）（圖6A-F）?？傊琁r1@FA@MOFs介導的 PDT 通過線粒體損傷驅動的銅死亡、鐵死亡和PAN凋亡的融合，在常氧和缺氧環(huán)境下協(xié)調(diào) ICD，缺氧增強的功效源于氧化還原循環(huán)放大的致死級聯(lián)通過多模式應激整合來啟動抗腫瘤免疫。

圖6 Ir1@FA@MOFs-PDT誘導腫瘤細胞發(fā)生免疫原性細胞死亡(ICD)。(A-E) 免疫熒光、流式細胞術和Western Blot。(F) ATP檢測試劑盒測量顯示胞外ATP濃度顯著升高

（7）Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療誘導的轉錄組改變

進行 RNA 測序以系統(tǒng)地評估缺氧條件下Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 對轉錄組的影響。主成分分析（PCA）顯示 PDT 治療組和對照組之間存在明顯的聚類關系，表明數(shù)據(jù)具有高度一致性和可重復性（圖7A）。差異基因表達分析發(fā)現(xiàn)，在處理過的樣本中，有 251 個基因顯著上調(diào)，757 個基因下調(diào)（|log2FC|> 1，p<0.05；圖7B）。京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析突出顯示了 52 條免疫相關途徑，代表最豐富的功能類別（圖7C）。在排名前 10 位的上調(diào)途徑中，關鍵的免疫調(diào)節(jié)過程被顯著激活，包括中性粒細胞胞外陷阱形成、白細胞介素 17（IL-17）信號傳導和腫瘤壞死因子（TNF）信號通路（圖7D）?；蚣患治?(GSEA) 證實，Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療 (PDT) 通過協(xié)同上調(diào)凋亡、壞死性凋亡和焦亡途徑誘導PAN凋亡 (PANoptosis)。這種多模式細胞死亡機制伴隨著大量的 ROS 生成和 GSH 耗竭，表明細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)嚴重紊亂。Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 通過激活 B 細胞的核因子 κ 輕鏈增強子 (NF-κB) 和 IL-17 通路激活 TNF-α 信號傳導來增強促炎免疫反應。同時，觀察到白細胞介素 2 信號轉導和轉錄激活因子 5 (IL2-STAT5) 信號軸的下調(diào)，表明調(diào)節(jié)性 T 細胞 (Treg) 成熟和分化受到抑制，這可能會減輕 TME 內(nèi)的免疫抑制 (圖 7E )。上述結果表明，Ir1@FA@MOFs介導的 PDT 發(fā)揮多方面的作用，包括通過線粒體損傷和氧化還原失衡誘導 PANoptosis、激活促炎免疫信號通路和重塑免疫抑制 TME。

圖7 轉錄組學分析揭示Ir1@FA@MOFs-PDT對細胞信號通路的系統(tǒng)性調(diào)控。 (A) 主成分分析（PCA）顯示，PDT治療組與對照組在基因表達譜上呈現(xiàn)顯著分離，表明治療引起了全局性的、可重復的轉錄本變化。 (B) 火山圖直觀展示了PDT治療后顯著上調(diào)（251個）和下調(diào)（757個）的差異表達基因（DEGs）。 (C, D) KEGG通路分類與富集分析表明，差異基因主要富集于免疫相關通路，其中中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成、IL-17和TNF等關鍵促炎信號通路被顯著激活。 (E) 基因集富集分析（GSEA）從通路層面證實，PDT治療顯著激活了與PAN凋亡（凋亡、壞死、焦亡）、活性氧生成及TNF-α/NF-κB等關鍵生物學過程相關的基因集

（8）Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療（PDT）抑制腫瘤生長并增強免疫激活

建立小鼠單側移植瘤模型，系統(tǒng)評估Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療（PDT）的抗腫瘤療效（圖8A）。定量分析顯示，Ir1@FA@MOFs-PDT組腫瘤抑制率約為50.86%，顯著高于順鉑對照組約37.36%的抑制率（圖8B、D ）。值得注意的是，在未接受光激活的Ir1@FA@MOFs的暗對照組中，未檢測到統(tǒng)計學上顯著的腫瘤抑制，證實了光依賴性治療機制。所有實驗組在整個治療過程中體重均保持穩(wěn)定，表明治療相關的全身毒性極?。▓D8C）。多模態(tài)組織學分析（免疫組織化學（IHC）和免疫熒光（IF））顯示Ir1@FA@MOFs -PDT組和順鉑組均出現(xiàn)廣泛的腫瘤損傷（圖8E）。具體而言，Ir1@FA@MOFs -PDT誘導增殖抑制（增殖細胞核抗原（PCNA），圖8F），銅死亡激活（FDX1，圖8G），鐵死亡激活（GPX4，圖8I）和PANoptosis誘導（裂解的caspase-3，磷酸化的混合譜系激酶結構域樣蛋白（p-MLKL）裂解的GSDMD圖8H）。相反，順鉑治療特異性上調(diào)了裂解的caspase-3，而其他細胞死亡模式標志物不受影響，進一步證實了順鉑的凋亡顯性細胞死亡機制。IF分析顯示，在用Ir1@FA@MOFs-PDT治療的腫瘤中，鈣網(wǎng)蛋白（CRT）膜易位增強，這是ICD的標志（圖8J）。同時，這種治療方式引發(fā)了強大的細胞毒性免疫激活，其特征是成熟樹突狀細胞（DC）從2.3％顯著增加到5.66％（p<0.01；圖8M ），腫瘤內(nèi)CD8⁺T細胞浸潤幾乎增加了一倍（7.0％vs 13.2％，p<0.01；圖8N）。這些免疫刺激作用通過效應分子的上調(diào)表達得到進一步放大：免疫組織化學顯示顆粒酶B（GZMB）（一種細胞毒性T淋巴細胞衍生的絲氨酸蛋白酶）的誘導，而干擾素-γ（IFN-γ）（一種協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫的多效性細胞因子）顯示出增加（圖 8K-L）。結果表明，Ir1@FA@MOFs介導的光動力治療不僅通過多種死亡途徑直接消滅腫瘤細胞，而且還重塑了免疫抑制性TME，表明其作為組合治療策略的潛力。

圖8 Ir1@FA@MOFs-PDT在體內(nèi)抑制腫瘤生長并激活抗腫瘤免疫。(B-D) 腫瘤生長曲線、小鼠體重曲線及實體瘤照片。(E-L) 腫瘤組織切片的H&E、免疫組化和免疫熒光染色。(M, N) 流式細胞術