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圖1 a) BSA/Fe-TA NPs形成示意圖。b) BSA/Fe-TA NPs穿過血腦屏障，在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞中積累，以減少細胞內(nèi)外過量的RONS，從而緩解OS，并另外調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化以抑制神經(jīng)炎癥，從而有效治療PD

（1）BSA/Fe-TA NPs的合成與表征

圖2a的TEM首先給出BSA/Fe-TA的整體形貌：15 nm、單分散、無晶格條紋，SAED僅見彌散暈圈，奠定“無定形球形納米顆?！钡奈锢砘A(chǔ)。同一顆粒的高分辨Fe 2p XPS（圖2b）進一步揭示其化學本態(tài)——主峰711.3/725.5 eV對應Fe 2p?/?與2p?/?，去卷積后出現(xiàn)709.7/723.4 eV（Fe2?）與711.2/713.7/727.2/730.7 eV（Fe3?）兩套特征峰，定量說明鐵中心以Fe2?/Fe3?混合價形式存在；該結(jié)果與圖1c的Fe K-edge XANES相互印證-吸收邊位置介于Fe箔（Fe?）與Fe?O?（Fe3?）之間，邊緣能量位移0.8 eV，確證價態(tài)非整數(shù)。為回答“鐵是否以原子級分散”這一結(jié)構(gòu)問題，圖2d的FT-EXAFS在R空間給出決定性證據(jù)：僅1.5 ?（Fe–N/O）與1.9 ?（Fe–S）兩個配位殼層，完全缺失金屬鐵2.13 ?的Fe–Fe鍵信號；圖2e–i的小波變換（WT-EXAFS）在k-R三維空間同樣只出現(xiàn)Fe–N/O與Fe–S的強度極大值，未檢測到任何Fe–Fe散射路徑，層層排除鐵團簇或納米晶存在的可能。由此，從形貌（無定形球）→價態(tài)（Fe2?/Fe3?混合）→近鄰結(jié)構(gòu)（Fe–N/O、Fe–S配位）→原子級分散（無Fe–Fe）形成完整證據(jù)鏈，確立BSA/Fe-TA納米顆粒中單原子鐵中心的核心結(jié)論。

圖 2. BSA/Fe-TA NPs的結(jié)構(gòu)和成分表征。a) BSA/Fe-TA NPs的TEM 圖像；插圖：選區(qū)電子衍射(SAED)圖案。b) Fe 2p的高分辨率XPS光譜。c) XANES 光譜和 d) Fe箔、FeS 2、Fe 2 O 3 、FePc 和BSA/Fe-TA NPs的Fe K邊的相應k3加權(quán)傅里葉變換光譜。e) Fe箔、f) FeS 2、g) Fe2O3、h) FePc和 i) BSA/Fe-TA NPs的k邊的小波變換 (WT )。j) BSA/Fe-TA NPs的放大HAADF-STEM圖像顯示分散的單個Fe原子呈亮點。k) BSA/Fe-TA NPs在R空間的相應EXAFS擬合曲線以及納米粒子中鐵中心的可能立體構(gòu)型的說明。l) BSA/Fe-TA NPs在k空間的 EXAFS擬合曲線

（2）BSA/Fe-TA NPs的多酶樣催化活性

研究人員首先利用DCFH-DA探針比較發(fā)現(xiàn)，BSA/Fe-TA NPs的熒光強度顯著低于TA及BSA-TA，表明其總ROS清除能力更強（圖3a）；隨后通過ESR檢測，研究人員觀察到DMPO/?O??與DMPO/?OH信號隨顆粒加入而遞減，直接證實自由基清除效果（圖3b,c）。進一步使用SOD試劑盒測定顯示，?O??清除率隨Fe3?濃度0–40 μg/mL線性上升（圖3d）。在CAT測試中，研究人員記錄到溶解O?產(chǎn)量在0–20 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量依賴，0.8 M H?O?條件下O?達15 mg/L（圖3e–g）。采用TMB-H?O?體系檢測發(fā)現(xiàn)，652 nm吸光度隨顆粒濃度增加而升高，Michaelis-Menten曲線及Lineweaver-Burk圖給出POD動力學參數(shù)（圖3h–j）。通過監(jiān)測NADPH 340 nm下降曲線，研究人員發(fā)現(xiàn)GPx活性隨顆粒濃度升高而增強（圖3k）。在NO-PTIO ESR實驗中，信號被顆粒削弱（圖3l）；ONOO?誘導的焦棓酚紅漂白被抑制，吸光度偏移減?。▓D3m）。對比實驗顯示，BSA/Fe-TA NPs的SOD、POD、GPx、TPx活性均高于TA、BSA-Fe、BSA-TA、Fe-TA對照。

圖3.BSA/Fe-TA NPs清除RONS并介導多種酶模擬活性。a) DCF與H2O2、TA、BSA-TA或BSA/Fe-TA NPs溶液混合的熒光光譜。b)在存在或不存在BSA/Fe-TA NPs的情況下，通過使用自旋捕獲劑DMPO捕獲?O2–獲得的DMPO–?O2–的ESR光譜。c)在存在或不存在 BSA/Fe-TA NPs 的情況下， DMPO– ?OH的ESR光譜，其中?OH是通過Fe2+和 H2O2之間的Fenton反應生成的。d)不同濃度BSA/Fe-TA NPs的SOD樣活性。e)不同濃度BSA/Fe-TA NPs下釋放的溶解氧。f)存在H2O2的情況下氧氣生成的代表性數(shù)碼照片。 g) BSA/Fe-TA NPs存在下不同H2O2濃度下的溶解氧生成。h)不同濃度下BSA/Fe-TA NPs的POD樣活性。相應的Michaelis-Menten圖i)和Lineweaver-Burk圖j)在不同濃度的H2O2 (5、10、20、30、40、50、100和200 mM)下，BSA/Fe-TA NPs。k) 不同濃度下BSA/Fe-TA NPs的GPx樣活性。l) ESR光譜評估BSA/Fe-TA NPs的NO清除能力。m) 使用指示劑焦性沒食子酚紅對BSA/Fe-TA NPs的ONOO-清除能力進行UV-vis光譜評估

（3）單原子納米酶BSA/Fe-TA NPs實現(xiàn)神經(jīng)元-小膠質(zhì)雙重保護：阻斷氧化損傷與神經(jīng)炎癥的機制驗證

研究人員系統(tǒng)評估了BSA/Fe-TA NPs對MPTP誘導的PD體外模型的神經(jīng)保護作用與機制。細胞攝取實驗表明，顆粒可被bEnd.3、SH-SY5Y、N2A及BV2細胞高效內(nèi)化且在80 μg/mL仍無細胞毒性。2 mM MPTP顯著降低SH-SY5Y細胞存活率，共孵育BSA/Fe-TA NPs后，細胞活力隨顆粒濃度升高而恢復，IC??區(qū)間左移，提示劑量依賴性神經(jīng)保護；在H?O?誘導的氧化損傷模型中亦觀察到相同趨勢。為闡明機制，研究人員采用CLSM與流式細胞術(shù)同步檢測胞內(nèi)ROS，結(jié)果顯示MPTP升高的ROS被BSA/Fe-TA NPs完全拉回正常對照水平（圖4a）。線粒體膜電位JC-1檢測發(fā)現(xiàn)，MPTP導致的紅色/綠色熒光比值下降被顆粒顯著逆轉(zhuǎn)，表明線粒體功能得到修復（圖4b）。Western blot進一步顯示，MPTP上調(diào)的cleaved caspase-3、cleaved caspase-9及PARP剪切片段在BSA/Fe-TA NPs處理后均被抑制至基線水平（圖4c），Annexin V/PI流式定量證實凋亡比例由MPTP組的~35%降至~8%（圖4d)。細胞裂解液多酶活性測定表明，顆粒處理后SOD、CAT、POD、GPx活性均提升2–4倍，同時胞內(nèi)NO熒光探針信號下降60%，ONOO?誘導的焦棓酚紅漂白被阻斷，吸光度損失<10%（圖4e,f)。與BSA-TA復合物對比，BSA/Fe-TA NPs在相同蛋白濃度下將MPTP損傷細胞的存活率再提高~20%，驗證鐵中心對神經(jīng)保護的增益作用。

在BV2小膠質(zhì)細胞炎癥模型中，研究人員采用流式細胞術(shù)檢測表面標志：LPS或H?O?刺激使CD86? M1型比例由8%分別升至68%與71%，共孵育BSA/Fe-TA NPs后CD86?比例回降至22%與25%，同時CD206? M2型由12%提升至48%與52%（圖4g–j)。ELISA結(jié)果顯示，H?O?升高的促炎因子IL-1β（~420 pg/mL）與IL-6（~380 pg/mL）被顆粒顯著抑制至接近基線，而抗炎因子IL-10由~40 pg/mL升至~240 pg/mL（圖4l–n)。綜合提示，BSA/Fe-TA NPs通過高效清除RONS，阻斷NF-κB、MAPK及NLRP3炎癥小體激活，抑制M1極化并促進M2轉(zhuǎn)換，從而協(xié)同減輕神經(jīng)元氧化損傷與神經(jīng)炎癥反應。

圖4.BSA/Fe-TA NPs 介導的神經(jīng)元保護和抗炎活性。（a）SH-SY5Y 細胞經(jīng)指定處理后，用 DCF 染料檢測細胞內(nèi) ROS 的 CLSM 圖像。（b）通過流式細胞術(shù)檢測用 MPTP 處理、BSA/Fe-TA NPs（加或不加 MPTP）處理后 SH-SY5Y 細胞中線粒體膜電位的變化。 （c）對SH-SY5Y細胞進行不同處理后的Western印跡分析，檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-9（C-9）、cleaved caspase-9（CC-9）、cleaved caspase-3（CC-3）和cleaved PARP（C-PARP）的表達。β-actin（Actin）被用作管家蛋白。（d）SH-SY5Y細胞經(jīng)指定處理后凋亡的誘導。（e）用ONOO –處理后SH-SY5Y細胞的細胞活力。（f）凋亡分析評估BSA/Fe-TA NPs在ONOO –誘導的氧化損傷后的神經(jīng)元保護作用。采用代表性流式細胞術(shù)檢測，評估在存在或不存在BSA/Fe-TA NPs的情況下，用LPS（g，i）或H 2 O 2（h，j）處理后，BV2小膠質(zhì)細胞極化為促炎性M1表型或抗炎性M2表型的情況。（k）小膠質(zhì)細胞極化及其相應的促炎或抗炎反應示意圖。ELISA試劑盒測定BV2細胞經(jīng)上述處理后，促炎性細胞因子IL-6（l）、IL-1β（m）和抗炎性細胞因子IL-10（n）的表達情況

（4）BSA/Fe-TA NPs跨血腦屏障機制解析與PD病灶精準蓄積

研究人員首先利用單層bEnd.3 Transwell模型測定BSA/Fe-TA NPs的跨膜效率，24 h內(nèi)透過率達41%，并在下室SH-SY5Y與BV2細胞中檢測到顆粒熒光，其強度顯著高于游離BSA組（圖5b–d）。在7 mg mL?1游離BSA競爭條件下，透過率下降約30%，提示白蛋白介導的轉(zhuǎn)運路徑參與。隨后，研究人員構(gòu)建三細胞人源BBB模型再次驗證顆粒的高效穿透能力。為明確內(nèi)吞機制，研究人員用nystatin/genistein預處理bEnd.3、SH-SY5Y與BV2細胞，Cy5標記顆粒的攝取量分別下降約45%、50%與55%，證實小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用（圖5e–h）。顆粒的負電性及TA苯環(huán)疏水結(jié)構(gòu)促進其與富含膽固醇/鞘脂的小窩結(jié)合，從而推動跨膜轉(zhuǎn)運（圖5n）。

在體實驗階段，研究人員通過7TMR成像觀察到PD小鼠腦內(nèi)顆粒蓄積明顯高于野生型。免疫熒光與Western blot結(jié)果顯示，腦微血管、神經(jīng)元、小膠質(zhì)以及紋狀體、黑質(zhì)均表達白蛋白受體SPARC，為顆粒的受體介導轉(zhuǎn)運提供靶點。藥代動力學研究測得顆粒血半衰期為4.59 h，有利于延長BBB作用窗口。DIR標記顆粒的活體熒光在6 h達到峰值并持續(xù)至24 h，離體腦熒光與ICP-OES定量結(jié)果一致，腦組織蓄積量約為2.3%ID g?1（圖5i–k）。腦片熒光成像顯示，顆粒主要分布在紋狀體與黑質(zhì)，并與TH?多巴胺神經(jīng)元及IBA-1?小膠質(zhì)細胞共定位，且與SPARC受體共域（圖5l,m）。綜上，研究人員證實BSA/Fe-TA NPs可通過小窩與SPARC雙路徑跨越血腦屏障，并有效富集于PD病灶區(qū)域的神經(jīng)元及小膠質(zhì)細胞。

圖5.BSA/Fe-TA NPs穿透BBB以及在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞中的蓄積。a)體外BBB transwell模型示意圖。b) 不同時間點BSA/Fe-TA NPs在BBB的轉(zhuǎn)運率。流式細胞術(shù)評估transwell下室中c) SH-SY5Y神經(jīng)元細胞和d) BV2小膠質(zhì)細胞對BSA/Fe-TA NPs的細胞攝取情況。e) 通過流式細胞術(shù)評估染料木黃酮和制霉菌素處理前后bEnd.3細胞對Cy5標記的BSA/Fe-TA NPs的細胞攝取情況。f) SH-SY5Y 細胞與 Cy5 標記的 BSA/Fe-TA NPs孵育后，分別加入或不加入細胞膜穴樣囊泡介導的內(nèi)吞抑制劑制霉菌素和染料木黃酮進行 CLSM 圖像。通過流式細胞術(shù)評估用染料木黃酮 g) 和制霉菌素 h)預處理的 SH-SY5Y 細胞對Cy5 標記的 BSA/Fe-TA NPs的細胞攝取。（i）在靜脈注射載 DIR 的 BSA/Fe-TA NPs 或游離 DIR后，在指定時間點拍攝的 PD 小鼠的熒光圖像。右圖：注射后24小時，PD小鼠腦組織的離體熒光成像。j)體內(nèi)成像和k)離體腦成像的DIR強度定量分析。注射Cy5標記的BSA/Fe-TA NPs 24小時后，PD小鼠腦切片的CLSM圖像，顯示了納米酶在l) 神經(jīng)元和m) 小膠質(zhì)細胞中的積累。n) BSA/Fe-TA NPs穿透BBB、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞的示意圖

（5）BSA/Fe-TA NPs緩解PD小鼠運動障礙與神經(jīng)炎癥的綜合治療效應

研究人員以MPTP（30 mg kg?1，每日腹腔注射，連續(xù)8天）構(gòu)建亞急性PD模型，并自第1天起每2天靜脈注射BSA/Fe-TA NPs（總劑量3次），系統(tǒng)評估其治療潛力。行為學檢測顯示：開野實驗中，研究人員記錄到治療組小鼠總行程較PBS組增加42%，中心停留時間延長38%；爬桿實驗平均耗時由14.3 s縮短至8.1 s；轉(zhuǎn)棒跌落潛伏期由85 s延長至142 s（圖6b–d6）。Morris水迷宮第5天，研究人員追蹤發(fā)現(xiàn)治療組搜索軌跡集中于目標象限，平臺穿越次數(shù)提高2.1倍，而游泳速度無差異，證實空間記憶顯著恢復（圖6e–g6）。免疫組化分析由研究人員獨立完成：黑質(zhì)TH陽性多巴胺纖維密度回升至正常水平的~80%，顯著高于PBS組的45%；α-syn熒光強度下降35%（圖6h）。與BSA-TA復合物對比，研究人員確認后者對上述行為及TH指標改善幅度不足50%，凸顯鐵中心的關(guān)鍵作用。機制驗證實驗由研究人員同步開展：SN區(qū)ROS熒光信號較PBS組降低52%，MDA含量下降46%（圖6i,j）；IBA-1陽性面積由38%降至12%，血清IL-6、IL-1β分別下降約50%與55%，IL-10升高2.2倍（圖6k–n）。免疫熒光共定位由研究人員完成，顯示CD206? M2型小膠質(zhì)比例由8%升至31%，且與納米酶信號高度重疊（圖6o,p）。綜上，研究人員證實BSA/Fe-TA NPs通過清除RONS、高效穿透BBB并驅(qū)動M2極化，顯著緩解PD小鼠運動障礙與神經(jīng)炎癥。

圖6.BSA/Fe-TA NPs與MPTP同時注射可有效預防PD進展。（a）BSA/Fe-TA NPs在小鼠模型中預防PD進展的治療時間線示意圖。進行行為測試，包括（b）曠場測試，（c）爬桿測試和（d）轉(zhuǎn)棒測試，以評估BSA/Fe-TA NPs的治療效果。（e）代表性路徑追蹤。（f）小鼠在接受納米酶或PBS對照治療后在Morris水迷宮測試中穿越平臺的時間。（g）小鼠在Morris水迷宮測試中在目標象限（逃生平臺的先前位置）所花費的相對時間。（h）免疫組織化學評估小鼠腦中TH的表達（腦切片比例尺：1000μm；放大圖像比例尺：50μm）。 （i）使用二氫乙錠（DHE）檢測試劑盒對腦切片中的ROS進行熒光標記，檢測不同處理后離體腦中的ROS水平（比例尺：50 μm）。（j）接受所示處理后，小鼠離體腦組織中的丙二醛（MDA）水平。（k）免疫熒光測定法評估小鼠腦中IBA-1的表達水平。接受所示處理后，從小鼠體內(nèi)采集的血清中抗炎細胞因子IL-10（l）和促炎細胞因子IL-6（m）和IL-1β（n）的水平。 （o）M2 表型小膠質(zhì)細胞的 CLSM 圖像，以及（p）接受所示治療后小鼠腦中 CD206 表達的相應定量熒光強度