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針對上述問題，青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科與康復(fù)大學(xué)材料修復(fù)與康復(fù)工程學(xué)院聯(lián)合團(tuán)隊(duì)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種硫化殼聚糖修飾的硫化銅納米團(tuán)簇（CuS@MSN-SCS），用于實(shí)現(xiàn)牙周炎治療中同步殺菌與骨再生的雙重功能。該納米制劑通過將CuS納米顆粒包覆于介孔二氧化硅（MSN）中，并進(jìn)一步引入氨基和硫酸化殼聚糖（SCS）進(jìn)行表面修飾，形成具有良好生物相容性和多功能響應(yīng)能力的核殼結(jié)構(gòu)。CuS@MSN-SCS不僅可通過Cu2?介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)誘導(dǎo)ROS生成，有效殺滅核梭菌（Fusobacterium nucleatum）等牙周炎關(guān)鍵致病菌，還能通過Cu2?促進(jìn)血管生成、SCS誘導(dǎo)骨形成，顯著促進(jìn)牙槽骨再生與組織修復(fù)。該文章于2024年5月20日以《Sulfated Chitosan-Modified CuS Nanocluster: A Versatile Nanoformulation for Simultaneous Antibacterial and Bone Regenerative Therapy in Periodontitis》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c00137）。

圖1 用于牙周炎治療的CuS@MSN-SCS的制備：(A)CuS@MSN-SCS的合成；(B)CuS@MSN-SCS在牙周炎治療中的深度滅菌和骨再生機(jī)制

（1）CuS@MSN-SCS 的制備過程

首先，該CS納米顆粒采用軟模板法合成核殼結(jié)構(gòu)。因檸檬酸鈉配體包覆，CuS納米顆粒帶負(fù)電（圖2A）。為克服TEOS水解產(chǎn)物亦帶負(fù)電、難以直接包覆的問題，先以CTAB為軟模板，通過靜電/疏水作用在CuS表面形成陽離子雙層，使其轉(zhuǎn)為正電；再在堿性條件下TEOS水解縮合，經(jīng)CTAB-硅酸鹽靜電作用生成CuS@MSN/CTAB。乙醇去除CTAB后，用APTES引入氨基得CuS@MSN-NH?，再與帶負(fù)電的SCS靜電結(jié)合，最終得到CuS@MSN-SCS。TEM與FE-SEM顯示各步修飾后粒徑遞增，核殼結(jié)構(gòu)清晰（圖2B-D）；Cu、S、O、N等元素映射證實(shí)材料的組成（圖2E）。

圖2 CuS@MSN-SCS的表征：(A)CuS@MSN-SCS合成示意圖；(B)TEM圖像；(C)FE-SEM圖像（白色虛線框表示元素映射區(qū)域）；(D)納米顆粒尺寸定量；(E)CuS@MSN-SCS的元素映射（Cu、S、O和N）

（2）CuS@MSN-SCS 成功制備的相關(guān)驗(yàn)證

FTIR（圖3A）中1070cm?1Si-O-Si對稱/非對稱伸縮振動峰證實(shí)MSN框架形成；CuS@MSN-NH?在3450cm?1出現(xiàn)-NH?伸縮振動峰；SCS修飾后1203cm?1出現(xiàn)S=O峰，且Si-O-Si與-NH?峰分別藍(lán)移至994與3310cm?1，表明SCS以非共價(jià)方式結(jié)合。XPS總譜（圖3B）可見Cu2p、O1s、C1s、Si2s/2p；CuS@MSN-NH?出現(xiàn)~400eVN1s峰；CuS@MSN-SCS在~168eV新增S2p峰。高分辨譜（圖3C）中Cu2p?/?與Cu2p?/?分別位于932.7與952.5eV，證實(shí)Cu(II)存在；S2p除CuS的S2?峰外，新增168.8/169.8eV-SO??峰；N1s中可見-NH?、C-N及401.9eV-NHSO??峰（占26.7%），定量給出CuS/-SO??摩爾比約1:4.5，確證SCS修飾。XRD（圖3E）保留CuS六方相特征峰（~48°）及23°非晶SiO?寬峰，表明晶體結(jié)構(gòu)部分保持。ζ電位（圖2F）由-10.4 mV經(jīng)CTAB、APTES、SCS逐步調(diào)節(jié)至10.6mV，證實(shí)了CuS@MSN-SCS的成功合成。

圖3 CuS@MSN-SCS的表面物理化學(xué)性質(zhì)：(A)FTIR光譜；(B,C)XPS光譜及Cu2p、S2p和N1s峰的解卷積；(D)XRD圖譜；(E)Zeta電位

（3）CuS@MSN-SCS 抑制核梭菌生長與生物膜形成的評估

研究人員評估了CuS@MSN-SCS對牙菌斑生物膜形成與成熟的關(guān)鍵菌種核梭菌的抗菌效果。如圖4A所示，50μg/mL CuS@MSN-SCS反而輕微促進(jìn)細(xì)菌生長，歸因于低濃度Cu2?作為應(yīng)激信號刺激細(xì)菌代謝；當(dāng)濃度升至100–300μg/mL時(shí)，菌落數(shù)隨劑量增加而顯著減少，250與300μg/mL組抑菌率均超95%（圖 4B）。結(jié)晶紫染色（圖4A）顯示，對照與50μg/mL組呈深紫色，表明生物膜生物量高；200–300μg/mL 組OD???值較對照下降約50%（圖4C），提示高濃度CuS@MSN-SCS具顯著抗生物膜活性?；?死染色（圖4A）進(jìn)一步證實(shí)，高濃度處理后生物膜厚度明顯變薄，死菌比例升高（圖4D）。進(jìn)一步經(jīng)過ROS檢測（圖4E）可知，50–150μg/mL時(shí)胞內(nèi)ROS無顯著變化；濃度≥200μg/mL時(shí)，ROS水平隨劑量升高而顯著增加。機(jī)制上，CuS@MSN-SCS釋放的Cu2?被H?O?還原為Cu?，隨后與H?O?發(fā)生類芬頓反應(yīng)，生成?OH并循環(huán)再生Cu2?，誘發(fā)氧化應(yīng)激（圖S6）。過量ROS通過DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細(xì)菌凋亡，從而抑制生物膜形成。

圖4 不同濃度下CuS@MSN-SCS的抗菌能力：(A)核梭菌的菌落照片、結(jié)晶紫染色和活/死熒光染色；(B)抑菌率定量；(C)生物膜生物量（OD590）定量；(D)生物膜平均厚度定量；(E)核梭菌胞內(nèi)ROS表達(dá)

圖S6 在37℃、PBS中，用ICP-AES測定1、3、5、7天內(nèi)Cu2?與SiO?^4-的釋放量

（4）CuS@MSN-SCS 生物相容性評估實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞相容性評價(jià)是判斷納米材料能否用于生物醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵。研究人員利用L929成纖維細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)的生物相容性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5A所示，除300μg/mL組外，L929成纖維細(xì)胞在Day1和Day2的存活率均高于75%，表明CuS@MSN-SCS在≤250μg/mL時(shí)具有良好的細(xì)胞相容性。而血實(shí)驗(yàn)（圖5B）顯示，各濃度CuS@MSN-SCS的上清液均未出現(xiàn)明顯溶血，溶血率均低于5%，符合醫(yī)用材料標(biāo)準(zhǔn)。綜上，CuS@MSN-SCS在250μg/mL以下濃度展現(xiàn)出卓越的生物相容性。

圖5 CuS@MSN-SCS的生物相容性：(A)與CuS@MSN-SCS納米顆粒共培養(yǎng)后L929細(xì)胞的細(xì)胞活力；(B)紅細(xì)胞溶血率。磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照（-），雙蒸水作為陽性對照（+）

（5）uS@MSN-SCS促進(jìn)牙周炎大鼠的骨再生

基于抗菌能力和生物相容性的結(jié)果，研究人員選擇了250μg/mL的CuS@MSN-SCS濃度用于治療大鼠牙周炎。他們采用結(jié)扎聯(lián)合高糖飲食的方法誘導(dǎo)大鼠牙周炎（圖6A）。將絲線結(jié)扎于大鼠上頜第二磨牙頸部，并喂食高糖飲食14天以誘導(dǎo)炎癥。隨后，局部應(yīng)用CuS@MSN-SCS治療10次，以臨床常用抗生素米諾環(huán)素（MiNo）作為陽性對照組進(jìn)行療效比較。與空白組相比，牙周炎組表現(xiàn)出明顯的骨量丟失，證實(shí)牙周炎模型建立成功（圖6B）。相比之下，CuS@MSN-SCS和MiNo組均表現(xiàn)出積極的治療效果，牙槽骨出現(xiàn)再生，且兩組之間無顯著差異。牙槽骨丟失（ABL）分析進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果（圖6C）。此外，CuS@MSN-SCS治療后大鼠體重顯著增加（圖6D），表明CuS@MSN-SCS對正常組織無明顯毒性。XPS分析檢測到CuS@MSN-SCS中存在痕量殘留的CTAB，已知CTAB對真核細(xì)胞具有一定毒性，但已有研究表明大鼠對CTAB具有一定耐受性，在飲用水中給予低于20mg/kg/天的劑量持續(xù)一年未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。因此，大鼠對CTAB的耐受性解釋了為何CuS@MSN-SCS中殘留的CTAB未引起明顯毒性反應(yīng)，未影響主要器官和體重。

圖6 CuS@MSN-SCS治療后牙周炎大鼠的骨再生觀察：(A)牙周炎模型建立示意圖；(B)上頜第二磨牙的3D micro-CT重建圖像和切片圖像（比例尺= 2 mm）。牙骨質(zhì)-釉質(zhì)交界（CEJ）和牙槽嵴頂（ABC）用紅色虛線標(biāo)記；(C)基于micro-CT圖像的ABL分析；(D)大鼠體重增長

（6）CuS@MSN-SCS治療后牙周組織免疫反應(yīng)和膠原沉積分析

研究人員們對鼠上頜第二磨牙牙周組織進(jìn)行了H&E和Masson染色分析（圖7A）。與空白組相比，牙周炎組表現(xiàn)出明顯的免疫反應(yīng)跡象，經(jīng)CuS@MSN-SCS或MiNo治療后，這些反應(yīng)明顯緩解?？瞻捉M牙周組織結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維排列有序，紡錘形纖維細(xì)胞和星形成纖維細(xì)胞沿纖維束排列。然而，牙周炎組結(jié)合上皮向牙根方向增殖和延伸，牙齦上皮可見上皮釘突，膠原纖維出現(xiàn)水腫變性，排列紊亂，伴有炎癥細(xì)胞浸潤。值得注意的是，CuS@MSN-SCS或MiNo治療后，牙齦上皮釘突減少，結(jié)合上皮增殖減輕，膠原纖維恢復(fù)線性排列，牙周組織炎癥明顯減輕，表明治療效果顯著。為更直觀反映治療效果，對炎癥細(xì)胞數(shù)量（圖7B）和膠原降解程度（圖7C）進(jìn)行定量分析。免疫反應(yīng)評分和膠原降解百分比均證實(shí)CuS@MSN-SCS納米顆粒能夠緩解炎癥并抑制膠原降解，從而促進(jìn)牙周炎治療中的牙槽骨再生。

圖7 CuS@MSN-SCS治療后牙周組織免疫反應(yīng)和膠原沉積分析：(A) 上頜第二磨牙牙周組織的H&E和Masson染色圖像。(B) 免疫反應(yīng)評分；(C) 膠原降解

（7）CuS@MSN-SCS治療后牙周組織炎癥和血管生成標(biāo)志物評估

為確認(rèn)炎癥緩解情況，科研人員們進(jìn)行了TNF-α 免疫組化染色，牙周炎組TNF-α表達(dá)明顯（圖8A）。CuS@MSN-SCS和MiNo治療后，炎癥水平顯著降低，且CuS@MSN-SCS組與MiNo組之間無顯著差異（圖8B），進(jìn)一步證實(shí)CuS@MSN-SCS納米顆粒在減輕炎癥方面的積極作用。炎癥與新生血管化和血管功能密切相關(guān)，兩者在骨愈合中起關(guān)鍵作用。因此，評估了血管生成標(biāo)志物CD31的表達(dá)（圖8A）。與其他組相比，CuS@MSN-SCS組CD31陽性的血管生成水平顯著升高（圖8C），這可歸因于CuS@MSN-SCS釋放的Cu2?離子和SCS的協(xié)同作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，CuS@MSN-SCS 具有緩解炎癥和促進(jìn)牙槽骨再生所需的新生血管化能力，在牙周炎治療中展現(xiàn)出顯著的體內(nèi)治療效果。

圖8 CuS@MSN-SCS治療后牙周組織炎癥和血管生成標(biāo)志物評估：(A) TNF-α和CD31的免疫組化染色；(B) TNF-α的平均光密度；(C) CD31的平均光密度