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針對上述問題，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院張猛/張澄團隊探討了當(dāng)心臟經(jīng)歷MI/R損傷時STING如何調(diào)節(jié)心肌鐵死亡的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，I/R誘導(dǎo)的線粒體損傷導(dǎo)致dsDNA釋放，隨后被cGAS識別，導(dǎo)致第二信使cGAMP的產(chǎn)生和STING的激活，STING 可以通過與GPX4的相互作用直接觸發(fā)心肌鐵死亡。STING與GPX4結(jié)合，促使自噬增強，隨后又反過來導(dǎo)致GPX4降解，從而促進心肌鐵死亡。利用AAV介導(dǎo)的GPX4過表達和施用STING拮抗劑是針對MI/R損傷的有效治療策略。研究強調(diào)STING作為預(yù)防MI/R損傷、改善患者預(yù)后和降低與缺血性心臟病相關(guān)的死亡率的潛在治療靶點。該文章于2025年04月25日以《STING Aggravates Ferroptosis-Dependent Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Targeting GPX4 for Autophagic Degradation》為題發(fā)表于《Signal transduction and targeted therapy 》（DOI：10.1038/s41392-025-02216-9）。

（1）I/R引起心肌細胞中cGAS-STING信號上調(diào)

8 周齡雄性 C57BL/6J 小鼠 I/R 模型（圖 1a、b）中，與假手術(shù)組相比，I/R 組心臟邊界區(qū)域胞質(zhì)雙鏈 DNA（dsDNA）含量顯著增加、cGAS 激活（圖 1c），cGAS 和 STING 蛋白表達顯著上調(diào)（圖 1d、e），而梗死核心區(qū)和非缺血區(qū)的 cGAS、STING 蛋白水平無顯著變化，免疫熒光結(jié)果證實 STING 在 I/R 邊界區(qū)域表達增強。從 WT、cgas?/? 或 Sting?/? 小鼠心臟分離的細胞中，僅 I/R 邊界區(qū)域的 CMs 出現(xiàn) cGAS 和 STING 蛋白上調(diào)，cgas?/? 或 Sting?/? 小鼠的 CMs 中該上調(diào)效應(yīng)不明顯，成纖維細胞和巨噬細胞未觀察到顯著差異（圖 1f、g），免疫熒光共定位進一步顯示 I/R 心臟邊界區(qū)域 CMs 的 STING 表達顯著上調(diào)（圖 1h）。體外實驗中，小鼠原代 CMs（MPCs）缺氧 / 復(fù)氧（A/R）模型（圖 1i）顯示，與對照組相比，A/R 處理后 MPCs 線粒體嚴重損傷（表現(xiàn)為腫大、縮短、增厚），同時伴隨 dsDNA 大量釋放，胞質(zhì)中出現(xiàn)不與細胞核或線粒體共定位的 dsDNA（圖 1j）。

圖1  I/R 誘導(dǎo) CMs 中 cGAS-STING 上調(diào)。（a）小鼠 I/R 模型手術(shù)流程圖；（b）小鼠 I/R 損傷模型示意圖；（c）WT 小鼠 I/R 或假手術(shù)組心臟邊緣區(qū)切片 dsDNA 與 cGAS 雙免疫熒光分析；（d、e）WT 小鼠 I/R 或假手術(shù)組心臟邊緣區(qū)分離細胞中 cGAS 和 STING 的 Western blot 檢測及定量分析；（f、g）cgas?/?、Sting?/?及 WT 小鼠 I/R 或假手術(shù)組心臟邊緣區(qū)不同細胞中 cGAS 和 STING 的 Western blot 檢測及定量分析；（h）WT 小鼠 I/R 或假手術(shù)組心臟邊緣區(qū)切片 CM 標志物與 STING 雙免疫熒光分析；（i）CM 缺氧復(fù)氧（A/R）操作流程圖；（j）A/R 后 MPCs 中 dsDNA 與線粒體雙免疫熒光分析

（2）心肌細胞特異性敲除cGAS或STING顯著減輕MI/R損傷

心肌細胞特異性cgas敲除（cgasfl/fl Myh6cre，cgas-CKO）和Sting敲除（Stingfl/fl Myh6cre，Sting-CKO）小鼠經(jīng)構(gòu)建用于MI/R損傷相關(guān)研究（圖2a）；KO小鼠與對照小鼠基線左心室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）無顯著差異，不存在內(nèi)在心功能異常。I/R后，cgas-CKO小鼠壞死面積減少、心功能（EF、FS）改善、纖維化面積降低（圖2b–d），cgas或Sting-CKO小鼠再灌注7天的心肌纖維化程度同樣減輕。體內(nèi)I/R模型中，對照心肌細胞在生理狀態(tài)下cGAS表達極低，I/R可誘導(dǎo)其表達，而cgas-CKO心肌細胞中該上調(diào)現(xiàn)象缺失（圖2e）；Sting-CKO小鼠呈現(xiàn)類似結(jié)果（圖2f–h），且I/R可誘導(dǎo)Stingfl/fl心肌細胞STING表達，Sting-CKO心肌細胞的STING蛋白水平不受I/R影響（圖2i）。

圖2 cGAS-STING缺失可減輕心肌I/R損傷。（a）cgas或Sting心肌細胞特異性條件性基因敲除小鼠結(jié)構(gòu)示意圖；b 心肌梗死面積及代表性組織切片；c 超聲心動圖及EF%、FS%測量；d Masson染色及纖維化面積百分比；e 心臟邊界區(qū)心肌細胞cGAS的Western blot及定量；f 心肌梗死面積（占AAR百分比）及代表性組織切片；g 超聲心動圖及EF%、FS%測量；h Masson染色及纖維化面積百分比；i 心臟邊界區(qū)心肌細胞STING的Western blot及定量

（3）STING通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷加劇心肌鐵死亡

Sting-CKO 小鼠與對照小鼠 I/R 后的心肌組織經(jīng) RNA 測序（圖 3a），京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示差異表達基因（DEGs）顯著富集于細胞生長和死亡通路（圖 3b）；I/R 后心肌 Tunel 陽性細胞增多，而 cgas-CKO 和 Sting-CKO 小鼠的 Tunel 陽性細胞水平顯著降低，但 Sting-CKO 小鼠與對照小鼠的凋亡標志物（Pro-caspase-3、Cleaved-caspase3、BCL-2）蛋白豐度無顯著差異，表明 STING 缺失可減輕 I/R 后的心肌細胞死亡，但并非通過調(diào)控凋亡（圖 3c）?；虮倔w論（GO）富集分析顯示，與 Sting-CKO 小鼠相比，Stingfl/fl 小鼠 I/R 后心肌組織中自溶酶體相關(guān)、氧化應(yīng)激及鐵死亡信號通路相關(guān)基因富集更為顯著（圖 3d）。A/R 處理后，STING 可有效促進脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛（MDA）生成，效果與陽性對照 Erastin 相當(dāng)，且 STING 激活能阻斷鐵死亡抑制劑 Fer-1 對 MDA 的抑制作用（圖 3e）；體外培養(yǎng)心肌細胞經(jīng) A/R 處理后活性氧（ROS）生成增加，F(xiàn)er-1 預(yù)處理可降低 ROS 水平，而加入 cGAMP 激活 STING 后，F(xiàn)er-1 對 ROS 的抑制作用顯著受阻（圖 3f）。Western blot 檢測顯示，Sting-CKO 小鼠 I/R 后心肌組織中?；o酶 A 合成酶長鏈家族成員 4（ACSL4）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFR）表達降低，谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）表達升高，溶質(zhì)載體家族 7 成員 11（SLC7A11）無顯著變化（圖 3g、h），A/R 處理的心肌祖細胞（MPCs）中也證實鐵死亡相關(guān)蛋白表達存在類似變化（圖 3i、j），且 Sting 缺失可阻斷 A/R 誘導(dǎo)的 GPX4 降解；qPCR 結(jié)果顯示，I/R 后 Stingfl/fl 與 Sting-CKO 小鼠心肌組織中 gpx4 mRNA 水平無差異，提示 GPX4 蛋白減少源于翻譯后調(diào)控而非轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

圖3 STING通過調(diào)控氧化應(yīng)激損傷加劇心肌鐵死亡。（a）I/R后用于RNA-seq的心臟區(qū)域示意圖；（b）RNA-seq的KEGG富集條形圖；（c）cgas-CKO、Sting-CKO及對照小鼠邊界區(qū)心臟切片Tunel免疫熒光統(tǒng)計圖；（d）RNA-seq的GO富集散點圖；（e）脂質(zhì)過氧化MDA分析；（f）MPC中ROS活細胞免疫熒光成像分析；（g,h）Stingfl/fl與Sting-CKO心肌細胞I/R后ACSL4、TFR、SLC7A11和GPX4的Western blot及定量；（i,j）Stingfl/fl與Sting-CKO的MPC在A/R或常氧條件下ACSL4、TFR、SLC7A11和GPX4的Western blot及定量

（4）STING直接靶向GPX4并與其相互作用

RNA-seq差異表達基因的京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示，鐵死亡相關(guān)基因顯著富集（圖4a）；通過心肌干細胞（MPCs）中STING蛋白親和抗體的串聯(lián)親和純化、免疫沉淀產(chǎn)物銀染（圖4b i）及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）分析（圖4b ii），鑒定出鐵死亡相關(guān)因子GPX4可能為STING的相互作用蛋白，分子對接預(yù)測STING（PDB ID: 4F5W）與GPX4（PDB ID: 5L71）存在10種潛在結(jié)合模式，Match-Align評分為8.157（圖4c）。內(nèi)源性免疫共沉淀（Co-IP）實驗表明，A/R后心肌細胞中內(nèi)源性STING與GPX4形成復(fù)合物，cGAMP可進一步增強該復(fù)合物形成（圖4d），且GPX4的內(nèi)源性純化產(chǎn)物中可檢測到STING（圖4e）；HeLa細胞中過表達Myc標簽STING（Myc-STING）和Flag標簽GPX4（Flag-GPX4）后，Myc或Flag IP實驗顯示兩者存在相互作用（圖4f、g），cGAMP處理可時間依賴性增強該相互作用，而Erastin則減弱其結(jié)合強度（圖4h）。免疫染色結(jié)果顯示，常氧條件下MPCs中STING低表達且與GPX4無共定位（圖4i i），A/R后STING激活并與GPX4形成聚集點（圖4i ii），cGAMP刺激后兩者大量聚集并共定位（圖4i iii），Erastin處理后共定位顯著減少（圖4i iv）；Stingfl/fl小鼠I/R心肌邊界區(qū)STING表達升高且與GPX4共定位（圖4j），而Sting-CKO小鼠中GPX4熒光增強且無STING共定位。

圖4 GPX4靶向STING。（a）KEGG顯示鐵死亡通路富集；（b）MPCs A/R后使用STING親和抗體進行串聯(lián)親和純化的銀染和LC-MS/MS分析；（c）STING與GPX4分子對接的十種潛在接觸模式圖像；（d）MPCs中內(nèi)源性GPX4與STING相互作用及cGAMP短時刺激影響的Co-IP分析；（e）MPCs中內(nèi)源性STING與GPX4相互作用及cGAMP短時刺激影響的Co-IP分析；（f）HeLa細胞中STING與GPX4相互作用的Co-IP分析；（g）HeLa細胞中GPX4與STING相互作用的Co-IP分析；（h）HeLa細胞中Erastin或cGAMP處理下GPX4與STING相互作用受cGAMP時間梯度或Erastin影響的Co-IP分析；（i）HeLa細胞中STING和GPX4共定位的雙免疫熒光分析；（j）Stingfl/fl或Sting-CKO邊界區(qū)心臟切片中GPX4和STING共定位的雙免疫熒光分析

（5）STING與GPX4在GPX4的N146位點和STING的T267位點發(fā)生直接相互作用

基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中 Apo STING（PDB ID: 4F5W）和 GPX4（PDB ID: 5L71）的相互作用預(yù)測，STING 可能通過 Y167、E260、Y245、Q266 或 T267 位點與 GPX4 的 G126、R127 或 N146 位點結(jié)合（圖 5a）。HeLa 細胞中 Flag-GPX4 突變體與 Myc-STING 的 IP 實驗顯示，僅 Flag-GPX4-ΔN146 突變體喪失與 STING 的相互作用（圖 5b）；Myc-STING 突變體實驗中，僅 Myc-STING-ΔT267 突變體無法與 GPX4 結(jié)合（圖 5c）。穩(wěn)定過表達 Myc-STING 和 Flag-GPX4 的 HeLa 細胞中，STING 缺失 T267 位點或 GPX4 缺失 N146 位點時，兩者共定位完全消失（圖 5d）。超分辨成像顯微鏡（SIM）觀察顯示，轉(zhuǎn)染 Myc-STING 和 Flag-GPX4 質(zhì)粒的 HL-1 細胞中，兩者存在強烈結(jié)合與共定位（圖 5e）；cGAMP 可促進 STING-GPX4 復(fù)合物形成，但 Flag-GPX4-ΔN146 與 Myc-STING 共轉(zhuǎn)染時，即使加入 cGAMP 也無法恢復(fù)共定位，證實 N146 和 T267 位點為兩者相互作用的關(guān)鍵位點。

圖5 STING與GPX4通過GPX4的N146和STING的T267氨基酸殘基直接相互作用。（a）GPX4與STING潛在結(jié)合位點的分子對接圖像；（b）HeLa細胞中Flag-GPX4及其點突變體與Myc-STING的Co-IP分析；（c）HeLa細胞中Flag-GPX4與Myc-STING及其點突變體的Co-IP分析；（d）HeLa細胞中STING與GPX4及其突變體共定位的雙免疫熒光分析；（e）HL-1細胞中STING與GPX4在cGAMP處理下的共定位雙免疫熒光分析

（6）STING通過自噬-溶酶體途徑降解GPX4促進鐵死亡

STING 可促進 GPX4 蛋白降解，該過程是鐵死亡、活性氧（ROS）生成及脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。cGAMP（STING 激活劑）能降低 GPX4 蛋白水平，而鐵死亡抑制劑 Fer-1 對 GPX4 的升高作用可被 cGAMP 阻斷；Erastin 與 cGAMP 作用類似，STING 抑制劑 H-151 則能抑制 Erastin 誘導(dǎo)的 GPX4 降解（圖 6a、b）。蛋白降解途徑驗證顯示，僅溶酶體抑制劑（氯喹 CQ、NH4Cl）可有效阻斷 cGAMP 誘導(dǎo)的 GPX4 降解并增加其豐度，自噬晚期抑制劑巴佛洛霉素 A1（Baf A-1）能阻斷該降解，而自噬早期抑制劑（LY294002、3-MA、Wortmannin）及蛋白酶體抑制劑（MG-132、calpeptin）無此效果，表明 STING 通過促進自噬體與溶酶體融合介導(dǎo) GPX4 的自噬降解（圖 6c、d）。Sting 缺失可抑制 I/R 誘導(dǎo)的自噬（補充圖 2g）；RFP-GFP-LC3 雙熒光自噬示蹤系統(tǒng)顯示，A/R 條件下自噬激活，Sting-CKO 心肌祖細胞（MPCs）中黃色熒光點增多、紅色熒光點減少，提示自噬體 - 溶酶體融合受阻、自噬體成熟障礙（圖 6e–g）。三色免疫熒光分析顯示，A/R 激活 STING 后，Stingfl/fl MPCs 中出現(xiàn) LC3 斑點，且 STING、LC3 與 GPX4 存在明確共定位，Sting 缺失細胞中無此現(xiàn)象（圖 6h）。STING-GPX4 復(fù)合物最初定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) - 高爾基體中間室（ERGIC），隨后轉(zhuǎn)運至 COP-I 囊泡及 LC3 標記的自噬體；A/R 誘導(dǎo)的 GPX4-STING 斑點可被溶酶體相關(guān)膜蛋白 2B（LAMP2B）標記的自溶酶體膜環(huán)繞，表明 STING 可招募 GPX4 進入自噬體，通過自噬 - 溶酶體途徑降解（圖 6i）。

圖6 STING 通過自噬 - 溶酶體介導(dǎo)的 GPX4 降解促進鐵死亡。（a）Fer-1 或 cGAMP 對 MPCs 中 GPX4 表達的 Western blot 檢測及定量；（b）Erastin、cGAMP 或 H-151 誘導(dǎo)的 MPCs 中 GPX4 降解 Western blot 檢測及定量；（c）cGAMP 誘導(dǎo)的 MPCs 中 GPX4 降解及 MG-132、NH4Cl、氯喹、鈣蛋白酶抑制劑的阻斷作用 Western blot 檢測及定量；（d）cGAMP 誘導(dǎo)的 MPCs 中 GPX4 降解及 Baf A-1等的阻斷作用 Western blot 檢測及定量；（e–g）有無 A/R 處理的 Stingfl/fl 或 Sting-CKO MPCs 中 mRFP-GFP-LC3 標記的自噬流免疫熒光分析；（h）Stingfl/fl 或 Sting-CKO MPCs 中 GPX4、STING 與 LC3B 三重免疫熒光分析；（i）有無 A/R 處理的 MPCs 中 GPX4、STING 與 LAMP2B 三重免疫熒光分析

（7）AAV介導(dǎo)的GPX4過表達可緩解STING激活引起的心肌缺血再灌注損傷

攜帶心肌細胞特異性 cTNT 啟動子且標記 GFP 的腺相關(guān)病毒（AAV-GPX4）用于體內(nèi)實驗，小鼠尾靜脈注射該病毒 14 天后，術(shù)前 3 天腹腔注射 STING 激活劑 DMXAA 或 DMSO（圖 7a），Western blot 與免疫熒光染色證實心肌細胞中 GPX4 過表達效率（圖 7b）。DMXAA 可增大 I/R 后的心肌梗死面積，而 GPX4 過表達能顯著縮小該面積（圖 7c、d）；STING 激活會加劇 I/R 后的心臟功能障礙，GPX4 過表達則可明顯改善心功能，表現(xiàn)為 I/R 后左心室射血分數(shù)（EF）和短軸縮短率（FS）升高（圖 7e、f）。脂質(zhì)過氧化標志物 4 - 羥基壬烯醛（4-HNE）水平因 STING 激活顯著升高，GPX4 過表達可逆轉(zhuǎn)該升高趨勢，提示鐵死亡被抑制（圖 7g），心肌祖細胞（MPCs）中活性氧（ROS）積累檢測結(jié)果與此一致（圖 7h）。阻斷 cGAS/STING 信號或過表達 GPX4，可部分恢復(fù) A/R 條件下心肌細胞的 ATP 水平、線粒體膜電位（ΔΨm）、基礎(chǔ)線粒體呼吸、ATP 生成量及最大和備用呼吸容量（補充圖 4b–g），表明線粒體功能得到部分恢復(fù)。

圖7 AAV 介導(dǎo)的 GPX4 治療對 STING 激活引發(fā)的嚴重 I/R 損傷的心臟功能保護作用。（a）AAV 或 DMXAA 處理的 I/R 誘導(dǎo)心功能障礙時間線示意圖；（b）心肌細胞中 GPX4 過表達驗證的 Western blot；（c、d）心肌梗死面積；（e、f）超聲心動圖及 EF%、FS% 檢測；（g）心臟邊緣區(qū)切片 GPX4 與 4-HNE 雙免疫熒光分析；（h）A/R 后 DMSO 或 DMXAA 處理下，AAV-cTNT-GPX4 或 AAV-Control 感染小鼠心肌細胞中 ROS 免疫熒光成像分析

（8）STING抑制劑H-151可減輕心肌缺血再灌注損傷

I/R 術(shù)前小鼠腹腔注射 STING 抑制劑 H-151（每兩天一次，共 7 天）（圖 8a i），體內(nèi)心臟成像顯示心肌壞死范圍得到有效控制（圖 8a ii）；H-151 處理可減少梗死面積（圖 8b、c）、恢復(fù)心功能（圖 8d、e），并緩解 I/R 誘導(dǎo)的 4 - 羥基壬烯醛（4-HNE）水平升高，提示脂質(zhì)過氧化及鐵死亡被抑制（圖 8f）。體外實驗中，H-151 可阻斷 STING 與 GPX4 的相互作用（圖 8g）、抑制自噬流（圖 8h），進而減少活性氧（ROS）積累，減輕心肌鐵死亡（圖 8i）。

圖8 STING 是緩解 I/R 后心功能障礙的潛在治療靶點。（a）i. H-151 或 DMSO 處理的 I/R 誘導(dǎo)心功能障礙時間線示意圖；ii. I/R 后 DMSO 或 H-151 處理小鼠的心臟代表性照片；（b、c）心肌梗死面積；（d、e）超聲心動圖及 EF%、FS% 檢測；（f）心臟邊緣區(qū)切片 GPX4 與 4-HNE 雙免疫熒光分析；（g）A/R 后 DMSO 或 H-151 處理小鼠心肌細胞中 GPX4 與 STING 免疫熒光分析；（h）A/R 后 DMSO 或 H-151 處理小鼠心肌細胞中 mRFP-GFP-LC3 標記的自噬流免疫熒光分析；（i）A/R 后 DMSO 或 H-151 處理小鼠心肌細胞中 ROS 免疫熒光成像分析；（j）STING 促進 MI/R 損傷的機制示意圖