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針對(duì)上述問(wèn)題，上海交大高小玲團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞基質(zhì)仿生蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)，模擬蛋白質(zhì)的自然環(huán)境，采用透明質(zhì)酸（HA）和魚精蛋白（PRTM）自組裝形成蛋白質(zhì)載荷核心，并將其包裹在ApoE3重組高密度脂蛋白（rHDL）中，形成蛋白質(zhì)-HA-PRTM-rHDL仿生納米載體。此仿生納米載體不僅能夠保護(hù)蛋白質(zhì)藥物，還能促進(jìn)其穿越BBB并進(jìn)入腦細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)藥物的腦內(nèi)遞送和生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。該文章于2024年8月5日以《Brain Delivery of Protein Therapeutics by Cell Matrix-Inspired Biomimetic Nanocarrier》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（Doi:10.1002/adma.202405323）。

（1）蛋白質(zhì)-HA-PRTM-rHDL的制備與表征

通過(guò)自組裝工藝制備蛋白質(zhì)-HA-PRTM-rHDL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該納米載體能有效地裝載不同分子量和電荷性質(zhì)的蛋白質(zhì)，無(wú)需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，并且具有良好的BBB穿越能力和胞質(zhì)遞送效率。

圖1.蛋白質(zhì)-HA-PRTM-rHDL的制備、表征及配方優(yōu)化(A)Protein-HA-PrTM-rHDL制備示意圖。(B)不同相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)載體。(C)線性回歸方法模擬不同蛋白質(zhì)載體仿生納米載體優(yōu)化配方中HA/蛋白質(zhì)投料比(w/w)與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)之間的關(guān)系。(D)通過(guò)線性回歸模型建立了不同蛋白質(zhì)載體仿生納米載體最佳配方中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與PRTM/蛋白質(zhì)(w/w)的投料比之間的關(guān)系。(E)FRET Protein-HA-PrTM-rHDL進(jìn)行表征。(F)不同蛋白質(zhì)載體的仿生納米載體在透射電子顯微鏡和低溫電子顯微鏡下的形態(tài)。(G)裝載不同蛋白質(zhì)貨物的仿生納米載體的大小和Zeta電位。H)CAT、HA-PRTM-rHDL、CAT-HA-PRTM-rHDLCD光譜

（2）穿越BBB與腦細(xì)胞靶向遞送

通過(guò)在小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3上的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了HA-PRTM-rHDL穿越BBB的能力。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CAT-HA-PRTM-rHDL在12小時(shí)內(nèi)有效穿越了細(xì)胞層，并在腦損傷模型小鼠中實(shí)現(xiàn)了高效的靶向遞送。

圖2.蛋白質(zhì)-HA-PRTM-rHDL有效地穿透血腦屏障，靶向CCI小鼠的病變部位，并進(jìn)入ALS模型小鼠皮質(zhì)和脊髓。（A)將CAT制劑與bEnd.3細(xì)胞孵育4 h。（B)體外血腦屏障模型。(C)細(xì)胞培養(yǎng)7天后的單層熒光圖像。（D)血腦屏障模型第1天至第8天的TEER值。E)歸一化計(jì)算穿透的CAT百分比。(F)在上室加入不同的制劑4h后，BV-2細(xì)胞在基底室的熒光圖像和細(xì)胞攝取的定量分析。(H)半定量分析DIR標(biāo)記的CAT制劑在尾靜脈注射后不同時(shí)間點(diǎn)的腦分布。（I)在CCI模型小鼠尾靜脈注射不同CAT制劑后檢測(cè)腦組織CAT酶活性。(K)尾靜脈注射CAT檢測(cè)FITC標(biāo)記的CAT-HA-PRTM-rHDL3h在ALS小鼠皮質(zhì)和脊髓的分布；(2)肌萎縮側(cè)索硬化癥小鼠注射不同CAT劑型檢測(cè)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和脊髓CAT酶活性

（3）多種蛋白質(zhì)貨物的胞內(nèi)遞送與生物活性保持

在不同的腦細(xì)胞（如HT22、BV2和U87）中，HA-PRTM-rHDL成功遞送了各種電荷性質(zhì)的蛋白質(zhì)，并保持了它們的生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于游離蛋白質(zhì)，仿生納米載體顯著提高了蛋白質(zhì)的胞內(nèi)熒光強(qiáng)度和生物活性。

圖3.蛋白質(zhì)-HA-PRTM-rHDL促進(jìn)了有效的細(xì)胞內(nèi)遞送，并保存了各種蛋白質(zhì)的生物活性。（A)和(B)FITC標(biāo)記的CAT在HT22細(xì)胞和BV2細(xì)胞的胞質(zhì)遞送。(C)定量分析HT22細(xì)胞和BV2細(xì)胞內(nèi)FITC標(biāo)記的CAT的水平。(D)HT22細(xì)胞的過(guò)氧化氫酶活性。(E)HT22細(xì)胞的ROS水平、LDH活性和細(xì)胞活力。(F)不同劑型的FITC標(biāo)記CC在U87細(xì)胞內(nèi)持續(xù)時(shí)間。(G)定量分析U87細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記CC的水平。（H)CC的細(xì)胞毒性機(jī)制圖。（I)CC導(dǎo)入U(xiǎn)87細(xì)胞24小時(shí)后的細(xì)胞活力

（4）巨胞飲觸發(fā)的膜融合機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，HA-PRTM-rHDL通過(guò)巨胞飲途徑進(jìn)入細(xì)胞并通過(guò)膜融合機(jī)制實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)貨物的快速胞內(nèi)釋放，繞過(guò)了溶酶體途徑，有效保護(hù)了蛋白質(zhì)貨物的生物活性。

圖4.巨胞飲觸發(fā)的膜融合介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。（A)在不同的內(nèi)吞抑制劑存在下，CATHA-PRTM-rHDL與細(xì)胞結(jié)合。（B)激光共聚焦顯微鏡下，細(xì)胞在EIPA和阿米洛利存在下對(duì)CAT-HA-PRTM-rHDL的攝取。（C)CAT-HA-PRTM-rHDL與BV2細(xì)胞共孵育15分鐘的激光共聚焦圖像。(D)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)。（F)激光共聚焦顯微鏡下R18標(biāo)記的CAT-HA-PRTM-rHDL胞內(nèi)攝取。（G）在全內(nèi)反射熒光顯微鏡下孵育15分鐘后，DiO標(biāo)記的BV2細(xì)胞膜和R18標(biāo)記的CAT-HA-PRTM-rHDL15分鐘后共定位。（H)在BV2細(xì)胞中以10 μg mL/L的CAT濃度孵育15分鐘和2小時(shí)后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CAT（綠色）從載體上解離。(I)將BV2細(xì)胞與CAT-HA-PRTM-rHDL共孵育后進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察

（5）腦損傷小鼠模型中的治療效果

在TBI和ALS小鼠模型中，CAT-HA-PRTM-rHDL顯著改善了TBI小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，并延長(zhǎng)了ALS小鼠的生存期。這表明該仿生納米載體在蛋白質(zhì)治療藥物的CNS遞送中具有顯著的治療潛力。

圖5.CAT-HA-PRTM-rHDL可減輕CCI模型小鼠的神經(jīng)病理?yè)p傷并改善記憶缺陷。A)海馬區(qū)和大腦皮層GFAP和IBA1免疫組織化學(xué)染色顯示，CAT-HA-PRTM-rHDL處理組小膠質(zhì)細(xì)胞活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減弱。激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞（B)和小膠質(zhì)細(xì)胞(C)在海馬區(qū)和大腦皮層定量分析。(D)大腦皮層和海馬區(qū)Nissl存活神經(jīng)元定量分析。(E)逃生潛伏期。(F)跨臺(tái)時(shí)間。(G)逃生平臺(tái)先前所在的象限花費(fèi)的時(shí)間百分比。(H)代表性游泳路徑