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針對上述問題，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院張坤教授、浙江省人民醫(yī)院孫立濤教授、電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院蔡璐璐教授為其共同通訊作者。研究設(shè)計(jì)了一種多通道免疫納米調(diào)節(jié)器來抑制酸性 TME 并使非炎性巨噬細(xì)胞復(fù)極化，以根除這種癌癥免疫抑制的根源，其中氟碳鏈 (FC) 修飾的介孔二氧化硅 (FM) 分別作為納米反應(yīng)器和載體，原位合成 CaO₂和負(fù)載 R848，然后依次進(jìn)行脂質(zhì)體涂層、抗 CD105 修飾和 FC 介導(dǎo)的 O₂結(jié)合。脂質(zhì)體殼和顆粒內(nèi) FC 均可確保 CaO₂ 的安全輸送。超聲觸發(fā)的 FC 結(jié)合 O₂爆發(fā)和脂質(zhì)體破壞增強(qiáng)的 CaO₂與H⁺和 H₂O反應(yīng)產(chǎn)生O₂。這一過程消耗了預(yù)先存在的H⁺，抑制了糖酵解LA的產(chǎn)生，從而切斷了酸性TME的來源，并根除了它們在重塑癌癥免疫抑制中的作用，例如消除了向非炎癥性M2細(xì)胞極化的動力，標(biāo)本兼治地解決了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和PD-1⁺ T細(xì)胞失活等問題。癌癥免疫抑制的根除促進(jìn)了癌癥鈣化和免疫納米調(diào)節(jié)劑在腫瘤內(nèi)H₂O₂蓄積的抗腫瘤功效，尤其是在抗CD105介導(dǎo)的主動靶向蓄積之后。該文章于2025年9月26日以“Multichannel Immune Nanoregulators Suppress Lactic Acid Metabolism and Lactic Acid-Shaped Acidic Microenvironment to Uproot Anti-Tumor Immunosuppression”為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202512230）。

圖1 多通道免疫納米調(diào)節(jié)器原理示意圖

（1）AL@O₂-FMRC 的合成與表征

AL@O₂-FMRC的合成流程如圖2a所示，首先制備FM載體，隨后在其納米反應(yīng)器中原位合成CaO₂納米顆粒并裝載R848，獲得FMRC；經(jīng)脂質(zhì)體包覆并與CD105抗體螯合后得到AL@FMRC；最后通過O₂鼓泡使氟碳鏈結(jié)合氧，形成AL@O₂-FMRC。所得的FM載體分散性良好，呈現(xiàn)中空結(jié)構(gòu)，直徑約260 nm（圖2b-d），其殼層中均勻分布F原子，孔徑約為4 nm，具備介孔結(jié)構(gòu)（圖2e,f）。紫外吸收光譜顯示FMRC在320-340 nm處出現(xiàn)R848特征峰，表明R848成功裝載（圖2g）。脂質(zhì)體包覆與抗CD105修飾進(jìn)一步改變了材料形貌與表面化學(xué)性質(zhì)（圖2h,i）。元素分布圖與EDS譜圖顯示AL@FMRC中存在F、Ca、P和S等特征元素（圖2j,k），證實(shí)氟碳修飾、CaO₂合成、脂質(zhì)體包覆及抗體結(jié)合均成功完成。Zeta電位由FMRC的-29.8 mV轉(zhuǎn)變?yōu)長@FMRC的-20.1 mV，進(jìn)一步變?yōu)锳L@FMRC的-25.2 mV，亦反映表面組成的逐步變化（圖2l）。各階段材料粒徑保持穩(wěn)定（圖2m）。FTIR譜圖中出現(xiàn)CaO₂、FM、R848與抗CD105的特征峰，進(jìn)一步驗(yàn)證AL@FMRC結(jié)構(gòu)（圖2n）。負(fù)載率方面，CaCl?轉(zhuǎn)化為CaO₂的轉(zhuǎn)化率為10.3%，AL@FMRC中CaO₂負(fù)載率為4.3%；氟碳鏈包封率達(dá)100%，F(xiàn)原子負(fù)載率為15.47%；抗CD105抗體偶聯(lián)效率為52.1%，負(fù)載率超過1.78%。

圖2 AL@O₂-FMRC的合成與表征。(a)合成示意圖；(b) FM載體實(shí)物圖；(c, d)TEM與SEM圖像；(e, f)氮吸附等溫線與孔徑分布；(g)紫外-可見光譜；(h, i) TEM與SEM圖像；(j, k)元素分布圖與EDS譜；(l, m) Zeta電位與粒徑分布；(n) FTIR光譜；(o) O₂釋放示意圖；(p) 超聲后結(jié)構(gòu)顯微圖像；(q) O₂釋放動力學(xué)曲線；(r)不同條件下氧氣生成觀察；(s)pH隨時(shí)間變化；(t,u)R848與Ca2?釋放曲線

（2）US/pH 觸發(fā)的結(jié)合O₂的氟碳鏈和CaO₂釋放O₂

氟碳鏈賦予AL@FMRC攜氧能力，構(gòu)成最終的免疫納米調(diào)節(jié)劑AL@O₂-FMRC。超聲照射后材料結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞與擴(kuò)張（圖2p），證實(shí)了超聲觸發(fā)的可控氧釋放。通過氧指示探針檢測，AL@O₂-FMRC在超聲下呈現(xiàn)時(shí)間依賴性氧釋放，20分鐘內(nèi)達(dá)到釋放峰值（圖2q），表明氟碳鏈吸附的氧為突發(fā)釋放，難以持續(xù)緩解腫瘤微環(huán)境。為克服此局限，在FM中原位合成的CaO₂通過脂質(zhì)外殼與內(nèi)部氟碳鏈?zhǔn)杷畢^(qū)形成雙重阻隔，延緩其與水或H?接觸，實(shí)現(xiàn)持續(xù)氧供給。在無超聲條件下，AL@O₂-FM與AL@FMC均無明顯氣泡產(chǎn)生；超聲觸發(fā)后，AL@FMC產(chǎn)生壁附著小氣泡（持續(xù)釋放），而AL@O₂-FM出現(xiàn)更大融合氣泡（突發(fā)釋放）（圖2r）。含CaO₂組隨時(shí)間延長pH逐漸上升（圖2s），超聲通過破壞脂質(zhì)外殼加速水滲透與CaO₂反應(yīng)，進(jìn)一步提高pH，證實(shí)其緩解酸性微環(huán)境的能力。此外，超聲觸發(fā)的氧爆發(fā)與脂質(zhì)體破壞促進(jìn)免疫佐劑R848的釋放（圖2t），同時(shí)加速CaO₂與H?O反應(yīng)釋放更多Ca2?（圖2u），從而激活Ca2?介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

（3）細(xì)胞水平主動靶向、H⁺耗竭、O₂釋放、糖酵解抑制和鈣化，以減輕缺氧和酸性TME并抑制LA的產(chǎn)生

CaO₂除與H?O反應(yīng)生成Ca(OH)?和O₂外，還可與腫瘤內(nèi)H?反應(yīng)，消耗H?并生成H?O₂與Ca2?（圖3a）?？笴D105可使AL@O₂-FMRC特異性靶向并富集于高表達(dá)CD105的4T1腫瘤細(xì)胞，而在低表達(dá)的L-02細(xì)胞中積累較少（圖3b）。我們進(jìn)一步評估了AL@O₂-FMRC中CaO₂在4T1細(xì)胞內(nèi)與H?O和H?的反應(yīng)。含CaO₂組（G6–G8）的細(xì)胞pH顯著升高，表明CaO₂有效消耗H?，緩解酸性腫瘤微環(huán)境，其中G8因主動靶向與超聲促滲透作用具有最高pH及最低細(xì)胞外酸化速率（圖3c,d）。在氧含量與缺氧緩解方面，AL@O₂-FMR+US（G5）因超聲引發(fā)O₂釋放但無法持續(xù)供氧，缺氧緩解短暫（圖3e–i）。而含CaO₂組（G6–G8）中，氟碳鏈與脂質(zhì)體疏水區(qū)延緩H?O滲透，延長O₂釋放時(shí)間，使G8在短期與長期均維持最高O₂水平并最大程度緩解缺氧（圖3e-i）。隨著處理從G1到G8，癌細(xì)胞中LDHA表達(dá)及乳酸生成逐漸降低，G8因缺氧改善最顯著，LDHA與乳酸水平最低（圖3j–l）。含CaO₂組（G6–G8）引起明顯Ca2?蓄積，G8因主動靶向促進(jìn)納米顆粒內(nèi)化，Ca2?含量最高，鈣化程度也最強(qiáng)（圖3m,n）。同時(shí)，G8在超聲破壞脂質(zhì)體后促進(jìn)H₂O₂生成最多（圖3o）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，G8中HIF-1α下調(diào)、Calpain 1上調(diào)，說明該處理可有效緩解缺氧并促進(jìn)Ca2?沉積（圖3p,q）。

圖3 AL@O₂-FMRC緩解腫瘤缺氧與酸性微環(huán)境的細(xì)胞水平評估。(a)機(jī)制示意圖；(b)細(xì)胞對納米顆粒的攝?。t色：Cy5.5標(biāo)記納米顆粒；藍(lán)色：DAPI染核）；(c, d)各組細(xì)胞pH值；(e, f)細(xì)胞O2含量；(g-i)HIF-α表達(dá)水平；(j, k)LDHA表達(dá)；(l)乳酸含量；(m)細(xì)胞內(nèi)Ca2?；(n)細(xì)胞鈣化；(o)細(xì)胞內(nèi)ROS；(p, q)缺氧、鈣沉積及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)。注：G1-G8分別為Control、US、AL@FM+US、AL@FMR+US、AL@O₂-FMR+US、AL@O₂-FMRC、L@O₂-FMRC+US、AL@O₂-FMRC+US。US參數(shù)：1 MHz，60%占空比，1.0 W cm?2，脈沖照射1.5 min，間隔30 s；FM劑量為200 μg mL?1

（4）細(xì)胞水平抗腫瘤試驗(yàn)

為評估AL@O₂-FMRC在超聲作用下的系統(tǒng)效應(yīng)，首先檢測了線粒體膜電位變化。結(jié)果顯示，G8組細(xì)胞由高膜電位向低膜電位遷移最為顯著，表現(xiàn)為單體增多、J-聚集體減少，顯示細(xì)胞凋亡程度最高（圖4a）。Calcein-AM/PI染色進(jìn)一步證實(shí)G8處理對腫瘤細(xì)胞具有最強(qiáng)細(xì)胞毒性（圖4b,c），流式細(xì)胞術(shù)也顯示G8組細(xì)胞死亡率最高（圖4d）。使用Annexin V-mCherry/SYTOX green染色區(qū)分凋亡與壞死，發(fā)現(xiàn)G8組中凋亡與壞死共存細(xì)胞數(shù)量最多，壞死細(xì)胞核呈明顯綠色熒光（圖4e）。Western blot分析表明，促凋亡蛋白Caspase 3/7與Bax在G8組表達(dá)最高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)最低（圖4f,g）。以上結(jié)果說明，該多通道免疫納米調(diào)節(jié)劑在超聲促進(jìn)O2釋放及CaO2與H?O/H?反應(yīng)的協(xié)同作用下，通過誘導(dǎo)Ca2?與H?O₂積累、抑制乳酸生成與糖酵解、緩解缺氧與酸性微環(huán)境等系統(tǒng)效應(yīng)，有效觸發(fā)促凋亡蛋白表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡與壞死。

圖4 AL@O₂-FMRC在細(xì)胞水平的抗腫瘤效應(yīng)。(a)線粒體膜電位；(b, d)細(xì)胞活力定量、CLSM圖像及FCM分析；(c) Calcein-AM/PI染色（綠色：活細(xì)胞；紅色：死細(xì)胞）；(e)細(xì)胞凋亡/壞死染色；(f, g)凋亡相關(guān)蛋白WB條帶及半定量分析

注：G1-G8分別為Control、US、AL@FM+US、AL@FMR+US、AL@O₂-FMR+US、AL@O₂-FMRC、L@O₂-FMRC+US、AL@O₂-FMRC+US。US參數(shù)：1 MHz，60%占空比，1.0 W cm?2，脈沖照射1.5 min，間隔30 s；FM劑量為200 μg mL?1。

（5）細(xì)胞水平免疫原性細(xì)胞死亡 (ICD)、樹突狀細(xì)胞 (DC) 成熟和 TAM 極化

對多通道免疫納米調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）及免疫激活作用進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，G8處理顯著提升了癌細(xì)胞中鈣網(wǎng)蛋白（CRT）與熱休克蛋白70（HSP70）的積累，并促進(jìn)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）的釋放，使其細(xì)胞內(nèi)水平最低（圖5a-f）。同時(shí)，G8組細(xì)胞外ATP含量也降至最低（圖5g）。進(jìn)一步研究顯示，G8處理促使由癌細(xì)胞抗原誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成熟比例最高（圖5h–j），并促進(jìn)成熟樹突狀細(xì)胞分泌更多IL-6與TNF-α等抗腫瘤細(xì)胞因子（圖5k）。在巨噬細(xì)胞極化方面，AL@O₂-FMRC在超聲作用下釋放R848，可有效引導(dǎo)M0型巨噬細(xì)胞向M1表型極化（圖5l-o），并抑制其向M2型分化。此外，該處理還能將已有的M2型巨噬細(xì)胞重新極化為M1型，其中G8組的復(fù)極化率最高（圖5p-s）。細(xì)胞因子檢測結(jié)果進(jìn)一步印證，G8處理使M2相關(guān)因子IL-10顯著下降，M1相關(guān)因子IL-12顯著上升（圖5t,u）。以上結(jié)果表明，該多通道免疫納米調(diào)節(jié)劑可有效增強(qiáng)ICD反應(yīng)、促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，并引導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1抗腫瘤表型極化，從而系統(tǒng)激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。

圖5 細(xì)胞水平的免疫調(diào)控效應(yīng)。(a-c) ICD相關(guān)蛋白CRT、HSP70與HMGB1的免疫熒光圖像；(d-g) CRT、HSP70、HMGB1及ATP的半定量分析；(h) DC成熟實(shí)驗(yàn)示意圖；(i, j) 成熟DC的流式細(xì)胞術(shù)分析及統(tǒng)計(jì)；(k) DC中IL-6與TNF-α的分泌水平；(l) 不同表型巨噬細(xì)胞的形態(tài)觀察；(m, n) 巨噬細(xì)胞中IL-10與NO的表達(dá)；(o) M0巨噬細(xì)胞極化表型的免疫熒光圖像；(p, q) M0巨噬細(xì)胞CD206與CD86表達(dá)的流式分析；(r, s) M2與M1巨噬細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)分析；(t, u) M0巨噬細(xì)胞中IL-10與IL-12的分泌水平。注：G1-G8分別為Control、US、AL@FM+US、AL@FMR+US、AL@O2-FMR+US、AL@O₂-FMRC、L@O₂-FMRC+US、AL@O₂-FMRC+US。US參數(shù)：1 MHz，60%占空比，1.0 W cm?2，脈沖照射1.5 min，間隔30 s；FM劑量為200 μg mL?1

（6）體內(nèi)腫瘤生長抑制及免疫調(diào)控探索

在體內(nèi)抗腫瘤評估中，通過皮下移植腫瘤模型并靜脈注射納米調(diào)節(jié)劑，結(jié)合超聲照射進(jìn)行治療（圖6a）。藥代動力學(xué)顯示納米調(diào)節(jié)劑半衰期延長（圖6b），且主動靶向介導(dǎo)其在腫瘤中特異性積累并保留超過48小時(shí)（圖6c）。抗腫瘤效果方面，G8組表現(xiàn)出最顯著的腫瘤生長抑制（圖6d, e）和最低的腫瘤重量（圖6f, g）。含CaO₂組（G6-G8）中腫瘤組織水含量顯著下降，G8因超聲促進(jìn)CaO₂與H?O反應(yīng)而含水量最低（圖6h）。此外，G8處理組小鼠生存期顯著延長（圖6i）。機(jī)制研究表明，G8在提高腫瘤內(nèi)pH值（圖6j）及抑制乳酸生成（圖6k）方面效果最為顯著，糖酵解關(guān)鍵蛋白GLUT1與LDHA也呈現(xiàn)明顯下調(diào)（圖6l,m）。組織化學(xué)分析顯示G8組腫瘤細(xì)胞密度下降、血管形成受抑制、增殖減少及凋亡增強(qiáng)，分別通過H&E、CD31、Ki67和TUNEL染色證實(shí)（圖6n-q）。Western blot結(jié)果進(jìn)一步表明，G8中HIF-1α、LDHA和GLUT1表達(dá)下調(diào)，Calpain 1上調(diào)（圖6r），同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3/7與Bax表達(dá)升高，Bcl-2下降（圖6s）。以上結(jié)果表明，該多通道免疫納米調(diào)節(jié)劑通過緩解缺氧與酸性微環(huán)境、誘導(dǎo)鈣積累及凋亡，系統(tǒng)性地抑制腫瘤進(jìn)展。

圖6 AL@O₂-FMRC的體內(nèi)抗腫瘤效果。(a)治療流程；(b)藥代動力學(xué)曲線；(c)體內(nèi)熒光成像；(d)治療前后小鼠腫瘤照片；(e)腫瘤體積變化；(f, g)腫瘤照片與重量；(h)腫瘤含水量；(i)小鼠存活曲線；(j)腫瘤pH值；(k)腫瘤乳酸含量；(l, m)GLUT1與LDHA表達(dá)的熒光圖像與定量；(n, q)H&E、Ki67、TUNEL染色的組織圖像與定量；(o, q)CD31染色的微血管圖像與定量；(r, s)缺氧、鈣沉積、糖酵解及凋亡相關(guān)蛋白的Western blot分析。注：G1–G8分別為Control、US、AL@FM+US、AL@FMR+US、AL@O₂-FMR+US、AL@O₂-FMRC、L@O₂-FMRC+US、AL@O₂-FMRC+US。US參數(shù)：1 MHz，60%占空比，1.0 W cm?2，脈沖照射3 min，間隔30 s；FM劑量：10 mg kg?1/次，注射3次

（7）體內(nèi)癌癥免疫抑制緩解和免疫激活研究

為闡明多通道免疫納米調(diào)節(jié)劑在體內(nèi)增強(qiáng)抗腫瘤免疫的作用，對G1-G8各組處理后的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）水平及腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)分析。該調(diào)節(jié)劑通過緩解酸性TME、抑制糖酵解及乳酸生成，從根源上消除了M2型巨噬細(xì)胞極化的驅(qū)動因素，并有望恢復(fù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）功能、促進(jìn)自然殺傷（NK）細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞募集，同時(shí)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，伴隨G1至G8處理強(qiáng)度的遞增，抗腫瘤免疫反應(yīng)逐步增強(qiáng)。在超聲激發(fā)的G8組中，ICD標(biāo)志物CRT、HMGB1和HSP70表達(dá)顯著上升（圖7a, b）。流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步表明，G8組腫瘤組織中成熟樹突狀細(xì)胞（圖7c,d）與CD8? T細(xì)胞浸潤最多（圖7e, f），同時(shí)M1型巨噬細(xì)胞比例上升（圖7g,h），M2型下降（圖7i, j），表明巨噬細(xì)胞極化向抗炎M1表型轉(zhuǎn)變。此外，G8處理有效解除對NK細(xì)胞（圖7k, l）和CTL（圖7m, n）的抑制，恢復(fù)其活性。PD-1? T細(xì)胞數(shù)量也顯著增加（圖7o,p），有助于增強(qiáng)抗PD-1/PD-L1免疫治療效果。相應(yīng)地，G8組中免疫抑制性Treg細(xì)胞（圖7q,r）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）（圖7s,t）的浸潤程度最低。綜上所述，該多通道免疫納米調(diào)節(jié)劑聯(lián)合超聲（G8）可有效激活腫瘤免疫循環(huán)，逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境。

圖7 體內(nèi)免疫細(xì)胞分析。(a, b)腫瘤組織ICD標(biāo)志物CRT、HSP70、HMGB1的熒光圖像及定量；(c-t)流式細(xì)胞術(shù)檢測各類免疫細(xì)胞比例：(c, d)成熟DCs；(e, f)CD8? T細(xì)胞；(g, h)M1巨噬細(xì)胞；(i, j) M2巨噬細(xì)胞；(k, l) NK細(xì)胞；(m, n) CTL；(o, p) PD-1? T細(xì)胞；(q, r)Treg細(xì)胞；(s, t)MDSCs。注：G1-G8分別為Control、US、AL@FM+US、AL@FMR+US、AL@O₂-FMR+US、AL@O2-FMRC、L@O₂-FMRC+US、AL@O₂-FMRC+US。US參數(shù)：1 MHz，60%占空比，1.0 W cm?2，脈沖照射3 min，間隔30 s；FM劑量：10 mg kg?1/次，注射3次