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為了解決上述問(wèn)題，清華大學(xué)張洪杰院士、劉凱教授、萬(wàn)思康博士和中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所劉雅薇副研究員、華東師范大學(xué)孫靜研究員構(gòu)建了一種時(shí)序性免疫調(diào)控水凝膠（TIH），旨在通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控免疫-成骨微環(huán)境促進(jìn)感染性骨缺損修復(fù)。該水凝膠由改性蛋白與氧化海藻酸鈉通過(guò)席夫堿和光交聯(lián)反應(yīng)形成，模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)以支持細(xì)胞黏附與遷移，并摻入Zn/Ca磷酸鹽納米顆粒，實(shí)現(xiàn)Ca²⁺與Zn²⁺的時(shí)序釋放。其中Ca²⁺通過(guò)TRPC1-STAT1/NF-κB通路誘導(dǎo)早期M1巨噬細(xì)胞活化，加速病原清除；Zn²⁺則通過(guò)STAT6/PPARγ通路促進(jìn)M2極化，增強(qiáng)成骨分化。同時(shí)，水凝膠具有抗氧化和抗菌功能，進(jìn)一步改善早期感染清除和骨再生起始。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，該水凝膠在顱骨感染缺損模型中顯著促進(jìn)血管生成與成骨修復(fù)，驗(yàn)證了通過(guò)時(shí)序性免疫調(diào)控重塑骨愈合過(guò)程的可行性與臨床潛力。該文章于2025年9月20日以《Temporal Immunomodulatory Hydrogel Regulating the Immune-Osteogenic Cascade for Infected Bone Defects Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202514419）。

圖1 TIH的設(shè)計(jì)和功能。TIH制備示意圖。TIH通過(guò)按時(shí)間順序釋放Ca/Zn離子來(lái)調(diào)節(jié)免疫成骨微環(huán)境。此外，TIH還具有抗菌、抗氧化和血管生成特性，進(jìn)一步促進(jìn)感染性骨缺損中的成骨作用

（1）TIH的設(shè)計(jì)和制造

TIH通過(guò)光引發(fā)的雙重交聯(lián)策略構(gòu)建，采用含賴(lài)氨酸重復(fù)序列和EGF結(jié)構(gòu)域的重組蛋白KE作為主要成分，成功在大腸桿菌中合成并修飾為丙烯酸化蛋白。部分氧化的海藻酸鈉（OSA）作為醛基來(lái)源，可與KE形成席夫堿反應(yīng)。通過(guò)與OSA的共交聯(lián)反應(yīng)，形成類(lèi)ECM雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。為實(shí)現(xiàn)離子時(shí)序釋放，合成并修飾ZIF-L納米顆粒，進(jìn)一步礦化生成ZPH，XPS證實(shí)了Ca和Zn的存在（Figures 2b），SEM顯示其表面HA沉積并具有Ca/P≈1.7（Figures 2c）。KE-Acrylate、OSA與ZPH混合液在UV照射下3 min內(nèi)成膠（Figures 2d），具有良好的可注射性。。水凝膠具有10–50 nm的多孔結(jié)構(gòu)，EDS證實(shí)Ca、P、Zn均勻分布（Figure 2e）。流變學(xué)結(jié)果顯示G′高于G″并隨頻率增加（Figure 2f）。離子釋放實(shí)驗(yàn)顯示Ca2?在24 h內(nèi)快速釋放（≈60 mg L^-1），Zn²⁺則在7天內(nèi)逐步釋放（Figure 2g，h），符合M1→M2巨噬細(xì)胞時(shí)序極化需求。

圖2 TIH的制備與表征。a) TIH合成示意圖。b) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH納米粒子的高分辨率XPS光譜。c) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH納米粒子的SEM圖像。d) TIH的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，顯示其可注射和快速凝膠化能力。e) TIH的SEM和相應(yīng)的元素映射圖像，證實(shí)了多孔結(jié)構(gòu)以及Ca和Zn元素的存在。f) TIH的G′和G′′隨頻率的變化。g,h) 0.9％NaCl中TIH隨時(shí)間的Ca²⁺（g）和Zn²⁺（h）的釋放動(dòng)力學(xué)

（2）TIH體外促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成

CCK-8檢測(cè)顯示KO和TIH提取液均顯著提高BMSCs活力，TIH與KO相當(dāng)（Figure 3a），活死染色結(jié)果一致。BMSCs在TIH上附著和增殖良好，呈鋪展形態(tài)，且可在多孔結(jié)構(gòu)中遷移（Figure 3b）。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示KO和TIH均促進(jìn)細(xì)胞遷移，閉合率分別為65%和79%（Figure 3c,d）。血管生成實(shí)驗(yàn)表明KO和TIH均顯著促進(jìn)HUVECs管腔形成，TIH形成的血管網(wǎng)絡(luò)更為完整（Figure 3e,f）。ROS檢測(cè)顯示TIH顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，使H?O?誘導(dǎo)的ROS接近生理水平（Figure 3g,h），DPPH實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗氧化能力。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KO和TIH對(duì)MRSA和E. coli均具有抑菌作用，TIH在12 h內(nèi)對(duì)兩種菌株的抑制均超過(guò)90%。

圖3 TIH 的體外細(xì)胞相容性、遷移、血管生成和抗氧化能力。a) 用 CCK-8 測(cè)量與不同材料共培養(yǎng)的 BMSCs 的細(xì)胞活力。b) 與 TIH 共培養(yǎng)的 BMSCs 的 3D 形態(tài)。粘著斑蛋白免疫熒光染色顯示共培養(yǎng) 24 小時(shí)后，BMSCs 在 TIH 內(nèi)粘附并存活良好。c) 劃痕試驗(yàn)監(jiān)測(cè)不同處理下 BMSCs 的遷移活性。d) 通過(guò)測(cè)量劃痕愈合試驗(yàn)的面積定量分析不同處理下 BMSCs 的遷移活性。e) 管形成試驗(yàn)的代表性圖像評(píng)估不同處理下 HUVECs 的血管生成潛力。f) 定量分析不同處理下網(wǎng)狀和連接形成的狀況。g) DCFH-DA 染色圖像顯示不同處理下細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。在H2O2氧化環(huán)境中，經(jīng)TIH處理后，DCFH-DA的熒光強(qiáng)度減弱，顯示出其強(qiáng)大的抗氧化能力。h) 定量分析H2O2的細(xì)胞熒光強(qiáng)度。n = 5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。通過(guò)單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ns表示無(wú)顯著差異，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001

（3）通過(guò)TIH順序釋放離子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)

劃痕和增殖實(shí)驗(yàn)顯示TIH顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖與遷移。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2?水平在第1天顯著升高，隨后逐漸下降，而Zn2?水平在5天內(nèi)持續(xù)上升（Figures 4a–c），鈣離子熒光結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一時(shí)序釋放特征。流式及共聚焦分析顯示，TIH在第1天顯著上調(diào)M1標(biāo)志物CD86和iNOS，而M2標(biāo)志物CD206水平較低；第3天CD206顯著上升并伴隨CD86下降，表明由M1向M2的表型轉(zhuǎn)變（Figures 4d–f）。這一過(guò)程與Ca2?介導(dǎo)的早期M1極化及Zn2?誘導(dǎo)的后期M2極化相一致，表明TIH通過(guò)離子時(shí)序釋放實(shí)現(xiàn)了M1→M2極化調(diào)控，從而在感染清除與組織再生之間建立動(dòng)態(tài)平衡，加速骨修復(fù)。

圖4 TIH 體外調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣、鋅振蕩及巨噬細(xì)胞極化。a) FCM 測(cè)量干預(yù) 1 天和 3 天后巨噬細(xì)胞內(nèi) Ca 2?和Zn 2?熒光強(qiáng)度。b,c) 使用 FCM 測(cè)量定量分析 Ca 2+陽(yáng)性 (b) 和 Zn 2+陽(yáng)性 (c) 細(xì)胞的百分比。d) 免疫熒光染色圖像顯示 RAW264.7 巨噬細(xì)胞在與 TIH 共培養(yǎng)后從第 1 天的 M1 到第 3 天的 M2 的表型轉(zhuǎn)變（藍(lán)色：DAPI，綠色：CD206，紅色：iNOS）。e) FCM 檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面 CD86 和 CD206 的表達(dá)。f) FCM 分析巨噬細(xì)胞表面 CD86 和 CD206 的表達(dá)。n = 5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SD 表示。通過(guò)單因素方差分析和 Tukey 事后檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。** p < 0.01，*** p < 0.001

（4）免疫-成骨級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)增強(qiáng)成骨分化

BMSCs與KO或TIH共培養(yǎng)均顯著提高ALP活性，而與TIH及RAW264.7巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出最高的ALP活性和最強(qiáng)的礦化能力（Figure 5a–c）。免疫熒光及定量分析顯示，TIH+RAW264.7組顯著增強(qiáng)RUNX2、BMP-2、OCN和VEGF的表達(dá)（Figure 5d–h）。RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該組在上述基因水平上顯著上調(diào)（Figure 5i），表明TIH通過(guò)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫-成骨級(jí)聯(lián)調(diào)控促進(jìn)成骨與血管生成。

圖5 免疫成骨級(jí)聯(lián)調(diào)控對(duì)體外成骨分化的影響。a) 通過(guò)將 TIH 和 RAW 264.7 與 BMSCs 共培養(yǎng)來(lái)評(píng)估免疫成骨級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)對(duì)成骨分化的影響的實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。b,c) 不同處理下 BMSCs 的 ARS 染色 (b) 和 ALP 染色 (c)。d–g) 免疫熒光染色圖像顯示成骨分化標(biāo)志物，包括不同處理下 BMSCs 中的 BMP-2 (d)、RUNX2 (e)、OCN (f) 和 VEGF (g)。h) 量化 BMP-2、RUNX2、OCN 和 VEGF 的細(xì)胞熒光強(qiáng)度。i) RT-PCR 分析顯示 BMSCs 中 BMP-2、RUNX2、OCN 和 VEGF 的基因表達(dá)水平。n = 5 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。通過(guò)單因素方差分析和 Tukey 事后檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。（4）體外成骨評(píng)價(jià)

（5）使用TIH進(jìn)行感染性骨缺損的體內(nèi)再生

在感染性顱骨缺損大鼠模型中評(píng)價(jià)了TIH的骨再生能力（Figure 6a）。三維micro-CT結(jié)果顯示，TIH組在缺損邊緣及中央均表現(xiàn)出明顯的新骨形成，優(yōu)于KO組和對(duì)照組（Figure 6b）。定量分析表明，TIH組的BV/TV、BMD和Tb.N均顯著高于其他組（Figure 6c–e）。在抗菌性能方面，TIH組缺損部位肉芽組織中細(xì)菌負(fù)荷在7天后明顯低于對(duì)照組（Figure S27）。H&E染色顯示TIH組新骨形成量和骨連續(xù)性均優(yōu)于KO組和對(duì)照組（Figure 6f），MT染色進(jìn)一步證實(shí)TIH組缺損部位膠原沉積更豐富，顯示其更強(qiáng)的成骨分化能力（Figure 6g）。

圖6 TIH促進(jìn)體內(nèi)感染性骨缺損再生。a) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。b) 術(shù)后8周顱骨的3D Micro-CT重建圖像。c–e) BV/TV、BMD和Tb. N的定量分析，反映不同治療下的骨修復(fù)和再生效果。f,g) 術(shù)后8周顱骨的H&E (f)和MT (g)染色圖像。缺損區(qū)域用箭頭指示。底部圖像對(duì)應(yīng)于框中區(qū)域的放大視圖。NB：新骨，F(xiàn)：纖維組織，V：血管。n = 5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。通過(guò)單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001

免疫組化染色及定量分析顯示，TIH組BMP-2、RUNX2、OCN及VEGF的表達(dá)水平均顯著高于其他組（Figure 7a）。免疫熒光分析結(jié)果表明，TIH處理后CD86表達(dá)下調(diào)，而CD206表達(dá)顯著上調(diào)（Figure 7b；Figure S28）。主要臟器（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）組織學(xué)分析未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死或其他病理異常（Figure S29）。

圖7 TIH 治療感染性顱骨缺損后體內(nèi)成骨、血管生成和免疫調(diào)節(jié)表現(xiàn)。a) 不同處理下術(shù)后顱骨中 BMP-2、RUNX2、OCN 和 VEGF 蛋白的免疫組織化學(xué)染色圖像及相應(yīng)的定量分析。b) 不同處理下術(shù)后顱骨中 CD86 和 CD206 表達(dá)的免疫熒光染色圖像及相應(yīng)的定量分析，揭示體內(nèi)巨噬細(xì)胞的極化。n = 5 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均值±SD 表示。通過(guò)單因素方差分析和 Tukey 事后檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001