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針對上述問題，山東大學(xué)薛皓教授團隊設(shè)計了一個多模式生物模擬納米平臺（FBFO@HM@aOPN），旨在增強GBM中PDT-免疫療法的協(xié)同作用。該納米平臺將具有雙酶活性的納米酶（Fe3O4@BiFeO3，F(xiàn)BFO）包裹在由OMVs和M1EVs融合形成的雜化膜（HM）中，然后與pH敏感的抗OPN（aOPN）抗體結(jié)合以獲得FBFO@HM@aOPN。靜脈注射后，F(xiàn)BFO@HM@aOPN在GBM組織中積累，其中酸性TME觸發(fā)的aOPN釋放增加了血管通透性并促進了ECM重塑。同時，F(xiàn)BFO納米酶產(chǎn)生氧氣以緩解缺氧，提高了PDT的效率。HM進一步指導(dǎo)納米平臺靶向腫瘤細胞和TAMs，誘導(dǎo)鐵死亡（釋放新抗原）并將TAMs重新極化為M1樣表型。這種雙重作用激活了先天和適應(yīng)性免疫，與檢查點抑制劑協(xié)同作用，抑制了腫瘤的進展和復(fù)發(fā)。該文章于2025年8月18日以《Bioengineered hybrid dual-targeting nanoparticles reprogram the tumour microenvironment for deep glioblastoma photodynamic therapy》為題發(fā)表于《Nature communications》（DOI：10.1038/s41467-025-63081-2）。

圖1 研究示意圖

（1）FBFO@HM@aOPN納米粒子的制備與表征

首先，采用溶熱法合成了Fe?O?納米粒子（NPs）。隨后，向Fe?O?NPs中添加Bi3?和PVP，通過原位生長法獲得FBFO NPs（圖1a）。透射電子顯微鏡（TEM）顯示FBFO NPs的平均直徑約為30納米（圖2a）。進一步通過掃描透射電子顯微鏡（STEM）結(jié)合能量色散X射線光譜（EDX）和能量色散光譜（EDS）分析確認了FBFO NPs中含有Bi、Fe和O元素，如圖2b所示。X射線衍射（XRD）也證實了FBFO NPs的成功合成，如圖2c所示。這些結(jié)果共同驗證了FBFO NPs的成功合成。光學(xué)性質(zhì)是影響FBFO NPs光催化活性的主要因素。紫外-可見/近紅外光譜（UV-vis/NIR）顯示，Bi和Fe?O? NPs的摻雜拓寬了FBFO的光吸收范圍（圖2d），提高了光生載流子的分離效率，極大地增強了納米材料的光催化活性。如圖2e所示的方案，通過660納米激光照射（方程1）可以實現(xiàn)有效的空穴（h?）-電子（e?）對分離，隨后與水和氧氣結(jié)合，可以產(chǎn)生大量的羥基自由基（·OH）和超氧自由基（·O??）用于I型光動力療法（PDT）（方程2和3）。隨著Fe2?進一步轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3?，H?O?被轉(zhuǎn)化為·OH（方程4，模擬過氧化物酶，POD），這進一步增加了活性氧（ROS）的產(chǎn)生。產(chǎn)生的h?還可以將H?O?氧化產(chǎn)生O?（方程5，模擬過氧化氫酶，CAT），以維持缺氧TME中的光動力療法。接下來，通過亞甲藍（MB）降解和溶解氧分析儀實驗評估了NPs在660納米（0.5 W/cm2）激光照射下產(chǎn)生ROS和O?的能力。與Fe?O?組和其他組相比，F(xiàn)BFO組和激光組的MB吸收明顯顯著降低，而O?產(chǎn)生能力顯著增加（圖2f，g）。此外，通過電子自旋共振（ESR）光譜驗證了FBFO NPs介導(dǎo)的光動力療法中ROS（·OH和·O??）的產(chǎn)生（圖2h）。因此，F(xiàn)BFO NPs表現(xiàn)出優(yōu)異的催化活性，用于產(chǎn)生ROS（·OH和·O??）和O?，表明FBFO NPs在抗腫瘤PDT應(yīng)用中具有巨大潛力。

為了進一步提高FBFO的安全性、穩(wěn)定性和多功能性，用M1巨噬細胞來源的外泌體（M1EVs）和細菌膜囊泡（OMVs）的雜化膜（HM）包裹FBFO，獲得了FBFO@HM NPs（圖1b）。將分泌的OMVs以1:1的比例加入M1EVs中，孵育2小時，隨后超聲處理10分鐘，并在液氮中凍融5次，以獲得M1EV-OMV HMs。之后，將HMs和FBFO NPs經(jīng)過10次脂質(zhì)體擠出器擠出，形成相對均勻的FBFO@HM NPs。CLSM證實FBFO@HM NPs的表面被N?修飾的M1EVs所包裹（圖2j）。此外，通過CLSM觀察到M1EVs和OMVs融合成新的脂質(zhì)囊泡，其共定位信號與FITC標記的FBFO NPs包裹在一起（圖2k）。此外，如圖2l所示，蛋白印跡法揭示HMs從M1EVs（TSG101、CD63、CD81以及整合素α?β?，以及趨化因子受體CXCR4）和OMVs（FtsZ）中繼承了組分。此后，F(xiàn)BFO@HM NPs與aOPN抗體結(jié)合，獲得FBFO@HM@aOPN。具體而言，首先，苯甲醛-PEG2000-NHS連接劑與aOPN的氨基末端反應(yīng)，形成aOPN-PEG2000-BD。然后，aOPN-PEG2000-BD與DBCO-PEG5-NH?連接，形成酸敏感的苯甲酸亞胺鍵，合成aOPN-PEG2000-DBCO（圖1c），這使得aOPN能夠在酸性TME（pH 6.5）中控制釋放。通過Dil標記的HM和Alexa Fluor 647標記的aOPN的共定位證實了FBFO@HM上成功結(jié)合了aOPN（圖2m）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示FBFO@HM@aOPN呈現(xiàn)出具有內(nèi)核和外殼的均勻球形納米結(jié)構(gòu)（圖2n）。隨后，通過ELISA測量透析液中的aOPN抗體水平，驗證了aOPN和FBFO@HM之間苯甲酸亞胺鍵對酸性環(huán)境的響應(yīng)性，結(jié)果表明在pH 6.5時aOPN抗體的釋放量大于pH 7.4時（圖2o）。此外，通過ESR（圖2h）和MB降解實驗（圖2p）驗證了FBFO@HM@aOPN NPs介導(dǎo)的光降解過程中ROS（·OH和·O??）的產(chǎn)生。隨后，研究了FBFO@HM@aOPN NPs在不同pH值下催化H?O?分解產(chǎn)生O?的能力。與FBFO一樣，F(xiàn)BFO@HM@aOPN NPs在激光照射下產(chǎn)生ROS（圖2p）和O?（圖2q）。這些觀察結(jié)果表明，成功制備了具有光增強雙酶活性的FBFO@HM@aOPN生物雜化系統(tǒng)，能夠增強PDT的療效。

圖2.a FBFO納米顆粒尺寸和形態(tài)均勻的透射電子顯微鏡（TEM）圖像，比例尺：100 nm。b FBFO納米顆粒的元素分布圖，比例尺：100 nm。cFe?O?和FBFO納米粒子的XRD圖譜。d Fe?O?和FBFO納米粒子的紫外-可見/近紅外漫反射光譜。e FBFO工作機理示意圖。f Fe?O?和FBFO納米粒子對MB的降解效果。g Fe?O?和FBFO納米粒子的氧氣（O2）生成曲線。h不同組別電子自旋共振（ESR）譜圖。i氨基化（N3）修飾的M1EVs與DBCO-Cy5.5孵育后的代表性流式細胞術(shù)及定量分析。j CLSM分析，顯示N?修飾的M1EVs與DBCO-Cy5.5結(jié)合后的結(jié)果，比例尺：50 nm。k CLSM分析顯示M1EVs與外膜囊泡（OMVs）的共定位，比例尺：50 nm。l蛋白質(zhì)印跡法顯示HM從M1EVs（TSG101、CD63、CD81及整合素α4β1，以及趨化因子受體CXCR4）和OMVs（FtsZ）中繼承成分。m CLSM圖像分析顯示HM與aOPNs的共定位，比例尺：100 nm。n FBFO@HM@aOPN納米顆粒尺寸和形態(tài)均勻的TEM圖像，比例尺：100 nm。o ELISA定量檢測不同pH值下抗OPN的釋放量。p. 在指定條件下，F(xiàn)BFO@HM@aOPN對MB的降解和q. O?生成曲線

（2）體外催化活性和治療效果

為了評估FBFO@HM@aOPN NPs的PDT效果，使用CT2A GBM細胞系進行了一系列體外實驗。在隨后的實驗中，將受試者分為7組（I: PBS, II: aOPN, III: FBFO, IV: FBFO@OMV, V: FBFO@M1EV, VI: FBFO@HM, 和 VII: FBFO@HM@aOPN）。多種相互作用分子存在于M1EV膜表面，包括整合素α4β1，可以與內(nèi)皮細胞和GBM細胞上高表達的Icam1或Vcam1配體分子相互作用，促進膜包裹的納米粒子穿過血腦屏障（BBB）以及主動靶向腫瘤細胞。隨后使用Cy5.5標記的FBFO來評估其被CT2A GBM細胞的攝取。FBFO@HM@aOPN NPs處理的GBM細胞中Cy5.5的熒光強度更高，F(xiàn)BFO@M1EV-NPs或FBFO@HM-NPs處理的細胞也觀察到類似的熒光信號趨勢。此外，當用抗Icam1/Vcam1抗體阻斷時，攝取效率急劇下降（圖3a），表明M1EVs賦予了NPs主動靶向腫瘤細胞的能力。隨后使用2,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）作為探針評估細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。如圖3b所示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理組的綠色熒光強度略高于對照組。值得注意的是，F(xiàn)BFO@HM@aOPN聯(lián)合激光照射組在所有組中呈現(xiàn)出最強的綠色熒光強度。這些結(jié)果表明FBFO@HM@aOPN可以借助腫瘤靶向M1EVs將FBFO高效送入腫瘤細胞，并在激光照射下產(chǎn)生大量的ROS，增加癌細胞對氧化損傷的敏感性。為了評估FBFO@HM@aOPN的細胞毒性，對CT2A GBM細胞進行了標準的CCK8實驗。與其它組相比，F(xiàn)BFO@HM@aOPN聯(lián)合激光照射組的腫瘤細胞存活率顯著降低（圖3c）。缺氧對癌細胞的增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有深遠影響，從而強烈影響它們的生物學(xué)行為和惡性程度。因此，緩解缺氧條件可以抑制腫瘤細胞的抗氧化能力，促進氧化損傷。如圖3d所示，常氧條件下處理的GBM細胞比缺氧條件下處理的細胞抑制率高得多。即使在缺氧條件下，F(xiàn)BFO@HM@aOPN聯(lián)合激光照射組的腫瘤細胞存活率也顯著降低，表明FBFO@HM@aOPN的PDT可以克服缺氧微環(huán)境的限制。此外，F(xiàn)BFO@HM@aOPN NPs的光誘導(dǎo)殺傷效率明顯大于其他治療（圖3e）。這些結(jié)果表明FBFO@HM@aOPN NPs具有優(yōu)異的體外催化PDT效率。細胞內(nèi)ROS（·OH）的大量積累可以增加膜脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)細胞鐵死亡。為了驗證這一假設(shè)，通過測量丙二醛（MDA）水平評估細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，這是鐵死亡早期的指標。如圖3f所示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理顯著增加了脂質(zhì)過氧化，隨后的激光照射進一步加劇了脂質(zhì)過氧化。細胞出現(xiàn)腫脹、起泡，最終破裂（圖3g），這是鐵死亡的跡象。

鐵死亡被認為是一種免疫原性細胞死亡（ICD），其特征是釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），包括膜鈣網(wǎng)蛋白（CALR）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）和腺苷酸三磷酸（ATP）。與的預(yù)期一致，F(xiàn)BFO@HM@aOPN組的細胞膜上CALR表達明顯增加（圖3g）。此外，F(xiàn)BFO@HM@aOPN導(dǎo)致GBM細胞釋放的ATP和HMGB1增加（圖3h, i），從而誘導(dǎo)ICD并為APCs提供豐富的抗原，從而促進T細胞的浸潤和激活（圖3j）。

圖3. a流式細胞術(shù)分析顯示CT2A膠質(zhì)母細胞瘤細胞對Cy5.5標記的FBFO的內(nèi)化情況。右側(cè)圖像為Cy5.5-positive細胞定量分析結(jié)果。b CT2A膠質(zhì)母細胞瘤細胞經(jīng)DCFH-DA染色顯示NP誘導(dǎo)的ROS生成，比例尺：200 μm。c CT2A膠質(zhì)母細胞瘤細胞經(jīng)不同制劑處理后的細胞活力。d 低氧/常氧條件下的細胞活性。e流式細胞術(shù)分析CT2A膠質(zhì)母細胞瘤細胞經(jīng)不同制劑處理后在660 nm輻照下的Annexin V-FITC/PI凋亡情況。f 660 nm輻照下不同制劑處理的CT2A膠質(zhì)母細胞瘤細胞脂質(zhì)過氧化水平，采用丙二醛（MDA）檢測試劑盒測定。g CALR與Hoechst共染色的CT2A細胞經(jīng)660 nm輻照后共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。比例尺：50 μm。檢測660 nm輻照后不同制劑處理的CT2A膠質(zhì)母細胞瘤細胞培養(yǎng)上清液中釋放的人源HMGB1和iATP。j FBFO@HM@aOPN誘導(dǎo)ICD的示意圖及增強免疫治療的潛在機制

（3）FBFO@HM@aSPP NPs的體外促巨噬細胞M1極化能力

作者系統(tǒng)地研究了FBFO@HM@aOPN對巨噬細胞的影響。使用Cy5.5標記的FBFO來研究其被MΦ細胞的攝取，與對照組相比，HM包裹的NPs的Cy5.5熒光強度更高，且這種攝取可以通過中和Icam1/Vcam1抗體阻斷，表明M1EVs有助于將FBFO NPs遞送至MΦs（圖4a）。此外，與對照組相比，F(xiàn)BFO處理組的DCFH-DA熒光強度略有增加。然而，F(xiàn)BFO HM包裹的NPs呈現(xiàn)出最強的綠色熒光強度（圖4b），表明FBFO NPs可以被有效地遞送至巨噬細胞，并在激光照射下產(chǎn)生ROS。為了詳細探索FBFO@HM@aOPN處理的巨噬細胞的極化狀態(tài)，通過RNA測序（RNA-seq）分析了經(jīng)PBS（對照）或FBFO@HM@aOPN處理的MΦ細胞的轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果揭示了兩組之間的顯著差異（圖4c）?；鹕綀D顯示M1巨噬細胞標記物（Cd86、Cd80、Tnf和Il6）明顯上調(diào)，而M2巨噬細胞標記物（Cd206，由Mrc1基因編碼，以及Arg1）顯著下調(diào)（圖4c）。此外，基因本體（GO）分析顯示，與上調(diào)基因相關(guān)的富集生物學(xué)過程（GO BP）主要與免疫過程有關(guān)，包括天然免疫反應(yīng)、對I型干擾素（Ifn-β）和II型干擾素（IFN-γ）的細胞反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程的正向調(diào)控以及NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的規(guī)范。下調(diào)基因主要與基質(zhì)重塑等生物學(xué)過程有關(guān)（圖4d）。此外，基因集富集分析（GSEA）顯示，與上調(diào)基因相關(guān)的抗原呈遞途徑和T細胞趨化途徑在基因表達中富集（圖4e）?？傮w而言，轉(zhuǎn)錄組分析顯示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理組的大多數(shù)DEGs與M1巨噬細胞極化以及IFN介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)高度相關(guān)。與對照處理相比，F(xiàn)BFO@OMV和FBFO@M1EV處理均顯著上調(diào)這些標記物，而FBFO@HM@aOPN處理組的效果最為顯著（圖4f）。這些結(jié)果證實了FBFO@HM@aOPN NPs促進巨噬細胞從M0型向M1型極化的能力。在抗原交叉呈遞過程中，腫瘤抗原被APCs（如巨噬細胞）內(nèi)化，隨后呈遞給主要組織相容性復(fù)合體I類（MHC-I）分子，從而激活CD8+ T細胞。流式細胞儀分析顯示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理的巨噬細胞MHC-I分子表達增加（圖4g）。此外，使用表達卵清蛋白抗原（OVA）的CT2A（CT2A-OVA）作為模型系統(tǒng)時，流式細胞儀定量結(jié)果顯示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN刺激的巨噬細胞中與MHC-I相關(guān)的SIINFEKL肽顯著上調(diào)（圖4h），從而為通過這些FBFO@HM@aOPN刺激的TAMs激活特異性CD8+ T細胞奠定了基礎(chǔ)。由于抗腫瘤免疫涉及將M2巨噬細胞重極化為M1巨噬細胞，進一步研究了FBFO@HM@aOPN NPs將M2樣巨噬細胞極化為M1巨噬細胞的能力。發(fā)現(xiàn)FBFO@HM@aOPN NPs顯著降低了M2樣巨噬細胞的比例，通過Cd206標記物表達檢測（圖4i），表明FBFO@HM@aOPN NPs具有強大的能力將M2樣巨噬細胞重極化。為了證實FBFO@HM@aOPN NPs對巨噬細胞極化效果的普適性，從小鼠中分離出髓系細胞，并進一步培養(yǎng)和分化為骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs）（圖4j）。通過流式細胞術(shù)和qPCR分析檢測M1和M2巨噬細胞標記物的表達水平。如圖4k–m所示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN NPs顯著上調(diào)了M1巨噬細胞標記物和抗原呈遞處理相關(guān)因子的表達水平。此外，F(xiàn)BFO@HM@aOPN組中M2巨噬細胞標記物CD206的表達被強烈下調(diào)（圖4n）。這些結(jié)果表明FBFO@HM@aOPN NPs能夠在體外顯著地將M0和M2樣巨噬細胞極化為M1表型。為了進一步了解FBFO@HM@aOPN NPs如何促進巨噬細胞極化，探索了其中涉及的潛在機制。鑒于IFN產(chǎn)生與cGAS-STING激活之間的強關(guān)聯(lián)，隨后試圖確認FBFO@HM@aOPN NPs是否通過STING途徑調(diào)節(jié)巨噬細胞中的免疫反應(yīng)。GSEA結(jié)果也顯示，與PBS處理的Raw264.7細胞相比，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理組中上調(diào)的基因在通過STING途徑的細胞溶質(zhì)DNA感應(yīng)途徑中顯著富集（圖4o）蛋白印跡結(jié)果進一步證實FBFO@HM@aOPN有效增加了STING磷酸化（p-STING）水平及其下游IRF3轉(zhuǎn)錄活性的誘導(dǎo)（圖4p）。

TME中的缺氧及其誘導(dǎo)產(chǎn)物是STING激活的強抑制因子。因此，F(xiàn)BFO@HM@aOPN誘導(dǎo)的STING激活可能歸因于FBFO的CAT樣酶活性。此外，M1巨噬細胞的極化還受到多個信號通路的調(diào)控，其中NF-κB因子是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，NF-κB可被多種ROS和LPS/TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活。富集分析也顯示，與FBFO@HM@aOPN處理組相比，上調(diào)基因在NF-κB和Toll樣受體信號通路中顯著富集（圖4d, o）。如預(yù)期所示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理的巨噬細胞中p65磷酸化水平升高（圖4p）。結(jié)果顯示FBFO@HM@aOPN通過激活cGAS-STING和NF-κB通路有效地促進了M1巨噬細胞的極化（圖4q）?？傮w而言，這些體外結(jié)果表明FBFO@HM@aOPN能夠通過促進巨噬細胞M1極化、增加TAMs的抗原呈遞能力以及協(xié)同減輕TME免疫抑制來克服當前免疫治療中的挑戰(zhàn)，為增強體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)提供了有希望的機會。

圖4. a. 流式細胞儀分析顯示Raw264.7細胞攝取Cy5.5標記的FBFO。b. CLSM圖像顯示Raw264.7細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。標尺為200微米。c. 火山圖顯示Raw264.7細胞經(jīng)PBS或FBFO@HM@aOPN處理后的與巨噬細胞極化相關(guān)的DEGs表達譜。d. GO BP和（e）GSEA富集分析顯示PBS和FBFO@HM@aOPN處理的Raw264.7細胞之間DEGs的結(jié)果。f. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下Raw264.7細胞中CD80+CD86+的比例。g. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下Raw264.7細胞中MHC I+的比例。h. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下Raw264.7細胞中H-2Kb/SIINFEKL+的比例。i. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下Raw264.7細胞中CD206+的比例。j. 建立BMDMs的方法。k. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下BMDMs中CD80+CD86+的比例。l. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下BMDMs中MHC I+的比例。m. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下BMDMs中H-2Kb/SIINFEKL+的比例。n. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下BMDMs中CD206+的比例。o. GSEA富集分析顯示PBS和FBFO@HM@aOPN處理的Raw264.7細胞之間DEGs的結(jié)果。p. 蛋白印跡分析顯示Raw264.7細胞和BMDMs經(jīng)不同配方處理后的STING-IRF3和NF-κB p65磷酸化水平。q. FBFO@HM@aOPN將巨噬細胞重編程為M1樣表型的機制示意圖

（4）3D腫瘤球體模型中的腫瘤抑制

M1巨噬細胞能夠吞噬腫瘤細胞，從而抑制惡性腫瘤的進展。為了確定FBFO@HM@aOPN是否促進巨噬細胞吞噬作用，將經(jīng)過不同配方處理的tdtomato標記的CT2A細胞與經(jīng)過不同配方預(yù)處理的EGFP標記的RAW264.7細胞共培養(yǎng)。CLSM和流式細胞儀分析顯示，與對照細胞相比，經(jīng)過NPs預(yù)處理的RAW264.7巨噬細胞吞噬了更多的癌細胞（圖5a, b）。隨后，使用3D腫瘤模型，即通過共培養(yǎng)M2樣巨噬細胞和CT2A GBM細胞建立的多細胞腫瘤球體（MCTS），來研究FBFO@HM@aOPN穿透腫瘤的能力（圖5c）。為了確定FBFO@HM@aOPN是否增強靶向FBFO的遞送，將MCTS與Cy5.5標記的FBFO共孵育6小時。利用CLSM在Z-stack掃描模式下評估穿透效果（圖5d）。如圖5e所示，在FBFO@HM@aOPN處理組中，紅色熒光明顯擴散到MCTS的內(nèi)部。然而，在FBFO處理組中，紅色熒光大多分布在MCTS的外圍。這些結(jié)果表明，在TME的響應(yīng)下，F(xiàn)BFO@HM@aOPN顯著促進了PDT藥物深入腫瘤組織的穿透，克服了實體瘤中的自然物理屏障。通過分析MCTS中的缺氧水平和巨噬細胞表型來研究FBFO@HM@aOPN重塑異常TME的潛力。經(jīng)過12小時的FBFO@HM@aOPN處理后，使用缺氧綠色試劑對MCTS內(nèi)部的缺氧水平進行免疫熒光染色。FBFO@HM@aOPN處理的腫瘤球體顯示出最弱的綠色熒光強度，即使在核心區(qū)域也是如此。相比之下，PBS或游離FBFO處理的腫瘤球體顯示出強烈的綠色熒光信號（圖5f），證實了FBFO@HM@aOPN有效緩解了腫瘤缺氧。此外，F(xiàn)BFO@HM@aOPN組的球體最終體積顯著低于PBS組（圖5g）。根據(jù)流式細胞儀和ELISA分析，F(xiàn)BFO@HM@aOPN處理有效促進了M2樣巨噬細胞向M1樣表型的極化（圖5h, i），表明FBFO@HM@aOPN調(diào)節(jié)實體瘤中免疫抑制微環(huán)境的能力。這些結(jié)果表明，F(xiàn)BFO@HM@aOPN可以在重塑缺氧和免疫抑制微環(huán)境的同時，成功穿透自然物理腫瘤屏障，為增強體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)提供了有希望的機會。

圖5. a. CLSM圖像顯示CT2A GBM細胞（紅色）被重編程的M1巨噬細胞（綠色）殺傷。標尺為100 μm。b. 流式細胞儀分析顯示重編程的M1 BMDMs殺傷CT2A GBM細胞的比例。c. 體外3D腫瘤模型（MCTS）制備和（d）評估穿透潛力的示意圖。e. Z-stack CLSM圖像顯示經(jīng)過6小時孵育后，不同配方處理的Cy5.5標記的FBFO NPs在CT2A-BMDM多細胞球體中的穿透情況。標尺為250 μm。f. Z-stack CLSM圖像顯示用缺氧綠色試劑染色的CT2A-BMDM多細胞球體（MCTSs），以指示缺氧程度。標尺為250 μm。g. MCTSs體積的代表性照片（左）和不同配方處理的MCTSs在第7天的體積直方圖。標尺為200 μm。h. 流式細胞儀分析顯示不同配方處理下MCTSs中CD206+ BMDMs的比例。i. ELISA檢測MCTSs培養(yǎng)上清液中IFN-β、IL-6、TNF-α、CCL5和CXCL10的濃度

（5）體內(nèi)生物分布、生物相容性和抗腫瘤作用

M1EV膜上的特定蛋白，包括整合素α4和β1，已知對于促進BBB穿透至關(guān)重要。為了評估FBFO@HM@aOPN生物雜交遞送系統(tǒng)滲透BBB的能力，使用了Transwell?共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中bEnd.3細胞在上室培養(yǎng)，而原代BMDMs和CTA2細胞在下室培養(yǎng)（圖6a）。在上室中培養(yǎng)的bEnd.3細胞形成了一個完整的單層，其跨內(nèi)皮電阻（TEER）為200?300 Ω·cm（圖6b）。觀察到FBFO@HM@aOPN-NPs的BBB穿透能力與FBFO@M1EV NPs大致相同，但后者可被抗ICAM1/VCAM1阻斷（圖6c），表明FBFO@HM@aOPN NPs能夠更好地穿透BBB。為了確認M1EV膜包裹是否促進FBFO在GBM組織中的積累，將Cy5.5標記的FBFO系統(tǒng)注入表達熒光素酶CT2A（CT2ALuc）的小鼠，并實時監(jiān)測Cy5.5熒光。在注射后6小時，接受FBFO@HM@aOPN-NPs處理的小鼠大腦中觀察到更強的紅色熒光信號，且該信號在48小時內(nèi)仍可檢測到（圖6d），在FBFO@M1EV-NPs或FBFO@HM-NPs處理的小鼠腫瘤部位也觀察到類似趨勢的熒光信號（圖6d）。離體熒光圖像（圖6e）和對腫瘤負荷大腦及主要器官（包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）的定量熒光強度分析也顯示FBFO@HM@aOPN相對于腫瘤大小有大量積累，表明FBFO@HM@aOPN能夠穿透BBB并在腫瘤中積累。上述結(jié)果表明，F(xiàn)BFO@HM@aOPN具有合適的腫瘤靶向能力、腫瘤保留能力和生物相容性。進一步在體內(nèi)評估了FBFO@HM@aOPN的抗腫瘤效果。在腫瘤接種后的第六天，將CT2A腫瘤荷載小鼠隨機分為7組，然后接受各種處理（圖6g）。通過7天間隔的生物發(fā)光成像連續(xù)監(jiān)測腫瘤生長，以評估抗腫瘤效果。與PBS組中腫瘤的快速生長相比，單藥治療組顯示出適度的腫瘤抑制效果，而FBFO@HM@aOPN組顯示出顯著的腫瘤抑制效果（圖6h, i），這可能歸因于PDT誘導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷和TME調(diào)節(jié)的聯(lián)合效應(yīng)。所有腫瘤荷載小鼠在實驗結(jié)束時被處死，并對腫瘤切片進行H&E、Ki67和CD44染色，以深入研究抗腫瘤效果。結(jié)果揭示了FBFO@HM@aOPN治療組中腫瘤細胞生長受到顯著抑制，且細胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生減少（圖6j–l）。免疫熒光圖像清楚地顯示FBFO@HM@aOPN處理的腫瘤中CALR暴露增加（圖6m），表明在體內(nèi)成功誘導(dǎo)了免疫原性細胞死亡?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明FBFO@HM@aOPN NPs在體內(nèi)具有優(yōu)越的抗腫瘤能力。

圖6. a. 體外BBB模型示意圖。b. 在體外BBB模型中，不同時間點孵育后TEER（Ω·cm2）值。c. 通過檢測頂室和底室中的Cy5.5熒光強度確定不同配方的運輸比。d. 尾靜脈注射不同配方后，CT2A荷載小鼠在不同時間點的體內(nèi)Cy5.5熒光圖像。e. 離體Cy5.5熒光圖像（左）和f. 定量直方圖（右）顯示CT2A荷載大腦和主要器官的熒光強度。g. 在CT2A腫瘤模型中進行治療性FBFO@HM@aSPP干預(yù)的實驗設(shè)計。h. 代表性的生物發(fā)光圖像（左）和熒光強度定量（右），以及i. Kaplan–Meier生存曲線，顯示表達熒光素酶的CT2A荷載小鼠接受不同處理的結(jié)果。j. H&E染色的腦腫瘤組織切片，來自接受不同處理的CT2A腫瘤荷載小鼠。標尺為2 mm。k. CLSM圖像顯示Ki67（標尺為50 μm）、l. CD44（標尺為20 μm）和m. CALR（標尺為20 μm）染色的腦腫瘤組織切片，來自接受不同處理的CT2A腫瘤荷載小鼠

（6）ScRNA-seq分析顯示免疫重塑增加

為了進一步探究FBFO@HM@aOPN的抗腫瘤機制，在質(zhì)量控制、過濾和細胞注釋后，獲得了十三種細胞類型（圖7a）。發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的比例顯著下降。值得注意的是，識別出一個高表達干擾素調(diào)節(jié)基因（如CXCL10、ISG15和干擾素誘導(dǎo)蛋白IFITs）的細胞群，并將其命名為惡性-IFN細胞群（圖7a–c），這表明在體內(nèi)觸發(fā)了強烈的干擾素反應(yīng)。進一步分析了FBFO@HM@aOPN治療組中腫瘤細胞群的整體變化。差異基因分析顯示，在FBFO@HM@aOPN治療組中，惡性細胞群和惡性-IFN細胞群中分別有618個和890個基因顯著上調(diào)（圖7d）。隨后的KEGG富集分析顯示，與鐵死亡、凋亡以及免疫反應(yīng)相關(guān)的通路，包括TNF信號通路、通過STING的細胞溶質(zhì)DNA感應(yīng)通路、Toll樣受體信號通路和趨化因子信號通路，在上調(diào)基因中顯著富集。然而，HIF-1信號通路和粘著斑等通路在下調(diào)基因中顯著富集（圖7e），表明FBFO@HM@aOPN能夠緩解腫瘤缺氧和基質(zhì)沉積。

進一步分析了FBFO@HM@aOPN治療組中腫瘤髓系細胞和浸潤T細胞群的整體變化。通過降維分析，將BMDMs分為三個亞群：單核細胞、M1和M2亞群（圖7f），scRNA分析顯示，與PBS組相比，F(xiàn)BFO@HM@aOPN治療組中腫瘤浸潤BMDMs中M1巨噬細胞的比例增加，而M2巨噬細胞的比例相應(yīng)減少（圖7g）。此外，M1巨噬細胞標記物（CD86、Tnf、Ifnb1）、T細胞相關(guān)趨化因子（Ccl5、Cxcl10/11）和抗原呈遞分子（MHC復(fù)合體）的表達上調(diào)，而M2巨噬細胞標記物（Mrc1、Arg1、Il10和Vegfa）的表達在FBFO@HM@aOPN治療組中下調(diào)（圖7h）。隨后的HALLMARK富集分析顯示，上調(diào)基因主要與免疫過程相關(guān)，包括天然免疫反應(yīng)、對干擾素-β（IFN-β）和IFN-γ的細胞反應(yīng)、炎癥細胞因子的正向調(diào)控以及通過NF-κB通路的Tnfa信號傳導(dǎo)（圖7i）。此外，GSEA顯示，在治療組中，與抗原呈遞和吞噬作用相關(guān)的通路在BMDMs中顯著富集（圖7j）。

將淋巴細胞進一步分為六個亞群，即CD8+ T細胞、常規(guī)CD4+ T細胞（convCD4+T細胞）、調(diào)節(jié)性CD4+ T細胞（Tregs）、自然殺傷（NK）細胞、幼稚T細胞和一個增殖性淋巴細胞亞群（圖7k）。FBFO@HM@aOPN治療顯著促進了CD8+ T細胞和NK細胞群的擴增和增殖（圖7l），這可能歸因于體內(nèi)I型和II型干擾素通路的激活。進一步分析了與淋巴細胞效應(yīng)功能最相關(guān)的九個基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)它們主要在CD8+ T細胞和NK細胞群中高表達（圖7m）。此外，功能富集分析顯示，與T細胞激活相關(guān)的通路在上調(diào)基因中顯著富集，而與免疫抑制相關(guān)的通路在治療組的下調(diào)基因中顯著富集（圖7n）。氣泡圖顯示，治療組中效應(yīng)基因的表達上調(diào)，而大多數(shù)免疫檢查點基因的表達傾向于下調(diào)（圖7o）。最后，通過CellChat配體-受體分析分析了免疫細胞與GBM細胞之間的細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)，CD80/86共刺激和抗原呈遞（MHC-I/II）信號通路主要由BMDMs的一個亞群和CD8+ T細胞介導(dǎo)（圖7p），表明BMDMs可以作為激活的APCs，通過抗原呈遞和共刺激信號促進效應(yīng)T細胞的交叉呈遞，從而增強治療組中的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。綜合這些發(fā)現(xiàn)表明，利用FBFO@HM@aOPN進行的光免疫治療有可能通過促進M1巨噬細胞、細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）和NK細胞在腫瘤內(nèi)的浸潤，增強先天和獲得性免疫激活，從而促進免疫冷腫瘤向免疫熱腫瘤的轉(zhuǎn)化。

圖7. a. 均勻流形近似投影（UMAP）圖顯示13種主要細胞類型。點代表單個細胞，顏色代表不同的細胞群。樣本根據(jù)其來源（PBS和FBFO@HM@aSPP處理的GBM）進行區(qū)分。b. 兩個組織組的細胞密度分布。相對細胞密度高表示為亮巖漿色。c. 條形圖顯示兩個組織組中主要細胞類型的相對細胞比例。d. 差異基因表達分析顯示治療組與PBS組相比惡性細胞群和惡性-IFN亞群中上調(diào)和下調(diào)的基因。e. 條形圖顯示FBFO@HM@aSPP處理和PBS處理的惡性細胞之間DEGs的KEGG富集分析結(jié)果。f. UMAP圖顯示3種BMDM亞群。點代表單個細胞，顏色代表不同的細胞群。g. 兩個組織組的細胞密度分布。相對細胞密度高表示為亮巖漿色。h. 點圖顯示M1樣和M2樣標記基因的表達。i. 條形圖顯示FBFO@HM@aSPP處理和PBS-BMDM處理細胞之間DEGs的HALLMARK富集分析結(jié)果。j. GSEA顯示在治療組中，與抗原加工和呈遞以及吞噬作用的正向調(diào)控相關(guān)的基因顯著富集。k. UMAP圖顯示6種淋巴細胞亞群。點代表單個細胞，顏色代表不同的細胞群。l. 兩個組織組的細胞密度分布。相對細胞密度高表示為亮巖漿色。m. 細胞密度顯示效應(yīng)相關(guān)基因的表達。相對細胞密度高表示為亮巖漿色。n. 不同淋巴細胞亞群中DEGs的功能富集分析結(jié)果。顏色從藍色到紅色表示DE得分的絕對值從低到高。o. 點圖顯示免疫檢查點和效應(yīng)基因的表達。p. 在2D空間中可視化（CD80/CD86）和（MHC-I和MHC-II）通路的主要發(fā)送者和接收者。

（7）FBFO@HM@aOPN和ICB聯(lián)合治療可預(yù)防術(shù)后GBM復(fù)發(fā)

在臨床實踐中，手術(shù)干預(yù)被廣泛認為是早期實體瘤的主要治療選擇。然而，由于手術(shù)后殘留的腫瘤細胞，GBM幾乎在所有患者中都會在切除部位周圍復(fù)發(fā)。FBFO@HM@aOPN促進了干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄，I型和II型干擾素均能上調(diào)腫瘤細胞和BMDMs表面的PD-L1表達，從而增加腫瘤細胞的免疫逃逸程度。如預(yù)期所示，單細胞相互作用數(shù)據(jù)的分析顯示，在FBFO治療期間，腫瘤細胞與BMDM之間以及T細胞之間的PDL1-PD1通路被上調(diào)（圖8h）。隨后探索了FBFO@HM@aOPN與抗PD1抑制劑聯(lián)合是否能延緩腫瘤復(fù)發(fā)。手術(shù)過程和治療方案如圖8i所示。通過H&E染色對腫瘤切除腔和殘留腫瘤病灶進行成像（補充圖12a）。通過Luci+ CT2A細胞的生物發(fā)光（BLI）信號監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)。FBFO@HM@aOPN治療的腫瘤的BLI信號顯著降低（圖8j, k）。與抗PD1（aPD1）抗體聯(lián)合進一步增強了腫瘤抑制效果（圖8j, k）。此外，接受FBFO@HM@aOPN NPs和aPD1抗體聯(lián)合治療的小鼠的生存率顯著高于其他配方治療的小鼠（圖8l）。在FBFO@HM@aOPN和aPD1抗體聯(lián)合治療后，所有小鼠在第100天時均存活（圖8l）。隨后研究了從不同組收集的腫瘤中的浸潤性淋巴細胞。如圖8m所示，F(xiàn)BFO@HM@aOPN組和聯(lián)合治療組中T細胞、IFNγ陽性T細胞和GZMB陽性CTLs的比例顯著增加。有趣的是，F(xiàn)BFO@HM@aOPN與αPD1抗體聯(lián)合治療組對腫瘤再挑戰(zhàn)表現(xiàn)出最強的抵抗力。一起，這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)BFO@HM@aOPN與ICB療法的聯(lián)合是一種高度個性化的治療策略，有助于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

圖8. a. 流式細胞儀分析顯示CT2A荷載腦組織中f4/80+ CD45+細胞中（左側(cè)）CD86+、（中間）MHC I+和（右側(cè)）CD206+的比例。流式細胞儀分析顯示CT2A荷載腦組織中CD45+細胞中b. CD3+ T細胞、c. NK1.1+ CD3- NK細胞、d. CD3+ CD8+ TILs和e. GZMB+ TILs的比例。流式細胞儀分析顯示CT2A荷載脾臟中f. 中央記憶T細胞（TCM, CD3+CD44+ CD62L+）和g. 效應(yīng)記憶T細胞（TEM, CD3+ CD44+ CD62L-）的比例。h. 氣泡圖顯示PD-1/PD-L1活性（由TAMs和寄生蟲釋放）與PD-L1受體表達（由淋巴細胞亞群表達）在處理和未處理樣本之間的相互作用。i. 術(shù)后復(fù)發(fā)挑戰(zhàn)的CT2A GBM腫瘤的實驗設(shè)計示意圖。J. 代表性生物發(fā)光圖像和k. 熒光強度定量（右側(cè)），以及l(fā). Kaplan–Meier生存曲線，顯示表達熒光素酶的CT2A荷載小鼠接受不同處理的結(jié)果。m. 流式細胞儀分析顯示CT2A荷載腦組織中CD45+細胞中（左側(cè)）CD3+ T細胞、（中間）IFN-γ + T細胞和（右側(cè)）GZMB+ TILs的比例