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針對(duì)上述問(wèn)題，汪衛(wèi)平團(tuán)隊(duì)首次提出并驗(yàn)證“FSP1 基因沉默 + PDT”協(xié)同策略。該團(tuán)隊(duì)將近紅外光敏劑維替泊芬與陽(yáng)離子助脂質(zhì) DOTAP 共組裝，構(gòu)建可共遞送 FSP1 siRNA 與光敏劑的脂質(zhì)納米顆粒（FSP1/LNPs）。該納米顆粒在血液循環(huán)中穩(wěn)定，被動(dòng)富集于腫瘤；經(jīng)近紅外光照后，維替泊芬產(chǎn)生 ROS，耗竭 GSH 并放大脂質(zhì)過(guò)氧化，同時(shí) FSP1 siRNA 沉默 FSP1 表達(dá)，雙重打擊誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞鐵死亡和 ICD，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟與細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞活化。CT26 荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)SP1/LNPs 顯著抑制原發(fā)瘤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)，系統(tǒng)提升抗腫瘤免疫，為結(jié)腸癌精準(zhǔn)協(xié)同免疫治療提供了可臨床轉(zhuǎn)化的新平臺(tái)。該文章于2025年8月7日以《Synergizing Ferroptosis Suppressor Protein 1 Gene Silencing and Photodynamic Therapy Based on Photosensitive Lipid Nanoparticles for Colon Cancer Immunotherapy》為題發(fā)表于《ACS Nano》上（DOI: 10.1021/acsnano.5c06115）。

研究示意圖

（1）光敏脂質(zhì)納米粒的篩選與優(yōu)化

為了制造光敏LNP，如圖1 A-B所示，該研究將不同類(lèi)型的光響應(yīng)小分子，如卟啉、吲哚菁或BODIPY分子，加入高(10 mol %)或低(5 mol %)的LNP配方中。圖1C的電泳結(jié)果表明，只有卟啉類(lèi)的Ce6、Verteporfin和Hemin可在不降低siRNA包載效率的前提下與脂質(zhì)共組裝?；诖耍瑘D1D選定FDA批準(zhǔn)的近紅外光敏劑Verteporfin（5 mol %）用于后續(xù)制劑，其粒徑與PDI與無(wú)光敏劑對(duì)照相當(dāng)。隨后，圖1E-F顯示，以0-10 mol %的陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTAP逐步取代DSPC，粒徑由130 nm增至190 nm，ζ電位由-16.2 mV升至+3.5 mV。圖1G-H的流式結(jié)果指出，5 mol % DOTAP組的細(xì)胞攝取在1 h和4 h時(shí)分別達(dá)到無(wú)DOTAP組的2.54倍與2.06倍；DOTAP比例繼續(xù)升高反致攝取下降。圖1I的共聚焦成像進(jìn)一步證實(shí)，5 mol % DOTAP組4 h后的siRNA-內(nèi)體共定位Pearson系數(shù)降至0.55，顯著低于0 mol %組的0.78，說(shuō)明DOTAP促進(jìn)了內(nèi)體逃逸。綜上，Verteporfin-5 mol %/DOTAP-5 mol %/DSPC-5 mol %的配方被確定為最佳光敏LNP平臺(tái)，用于后續(xù)共遞送FSP1 siRNA與光動(dòng)力協(xié)同治療結(jié)腸癌的研究。

圖1.光敏LNP配方的篩選和優(yōu)化。A）不同光敏分子（卟啉、吲哚菁或BODIPY，高摩爾比//低摩爾比）配方圖片；B）基于卟啉、吲哚青氨酸或BODIPY的光響應(yīng)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)；C）10 mol %光敏分子載siRNA LNP的瓊脂糖凝膠電泳圖； D）不同光敏LNP制劑的大小和PDI值； E）不同DOTAP摩爾比的Verteporfin-LNP的大小和PDI值； F）光敏LNPs的Zeta電位； G）細(xì)胞攝取流式分析（4 h）； H）不同DOTAP比例Verteporfin-LNP在CT26細(xì)胞中1 h/4 h攝取量； I）0或5 mol % DOTAP LNP的內(nèi)吞體逃逸

（2）FSP1/LNPs的制備與表征

為了制備FSP1/LNPs，將FSP1 siRNA包封到設(shè)計(jì)的光敏LNPs中。圖2A顯示FSP1/LNPs粒徑145.4 nm、PDI 0.11；圖2B測(cè)得ζ電位?2.8 mV；圖3C證實(shí)其在PBS或10% FBS中96 h仍維持約150 nm，粒徑穩(wěn)定性良好。圖2D電泳表明N/P≥3時(shí)siRNA被完全包封；圖2E紫外光譜在254、420、690 nm同時(shí)出現(xiàn)siRNA與Verteporfin特征峰；圖2F的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指出，1 μM Verteporfin或12.5 nM FSP1 siRNA單用使CT26存活率降至72%與70%，而二者聯(lián)用并光照后存活率驟降至36%；圖2G計(jì)算的平均協(xié)同分為27.28；圖2H流式結(jié)果證明FSP1/LNPs遞送siRNA的效率優(yōu)于Lipo3000；；圖2I顯示，M-β-CD、氯丙嗪和染料木素顯著抑制攝取，提示FSP1/LNPs主要經(jīng)脂筏-、網(wǎng)格蛋白-及小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。

圖2.FSP1/LNPs的制備和表征。A）FSP1/LNPs的粒度分布和透射電子顯微鏡成像；B）FSP1/LNPs的Zeta電位；C）FSP1/LNPs在PBS中37℃恒溫96 h的穩(wěn)定性試驗(yàn)；D）不同N/P比的FSP1/LNPs的瓊脂糖凝膠電泳；E）FSP1siRNA、Verteporfin和FSP1/LNPs的UV?Vis吸收光譜；F）在光照(Xe燈，690 nm，2.7 mW/cm2，2min；n=3)下，與Verteporfin和FSP1 siRNA孵育的CT26細(xì)胞的細(xì)胞活力；G）光照射下CT26細(xì)胞中維替泊芬和FSP1 siRNA的協(xié)同作用分?jǐn)?shù)；H）細(xì)胞對(duì)游離siRNA、Lipo3000-siRNA復(fù)合體和光敏脂質(zhì)納米粒的攝取水平；I）CT26細(xì)胞經(jīng)不同內(nèi)吞抑制劑孵育后FSP1/LNPs的細(xì)胞內(nèi)化水平

（3）FSP1/LNP的細(xì)胞毒性和FSP 1基因的沉默效應(yīng)

為了探索納米顆粒的抗癌性能，該研究將CT26細(xì)胞暴露于FSP1/LNPs或陰性對(duì)照sirna負(fù)載的光敏LNPs (NC/LNPs)中，圖3A的MTT結(jié)果顯示，F(xiàn)SP1/LNPs光照組對(duì)各濃度CT26細(xì)胞的抑制率最高；圖3B LDH釋放量在該組亦達(dá)峰值，提示膜完整性受損。為了確定結(jié)腸癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激，采用DCFH-DA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。圖3C流式檢測(cè)表明，F(xiàn)SP1/LNPs光照組胞內(nèi)ROS水平最高，顯著高于NC/LNPs光照組及FSP1/LNPs無(wú)光照組。圖3D-E凋亡分析顯示，F(xiàn)SP1/LNPs光照組晚期凋亡比例為NC/LNPs光照組的1.71倍；圖3F活/死染色呈現(xiàn)一致趨勢(shì)。為了探究光敏LNPs對(duì)FSP1基因的沉默作用，圖3G qPCR的結(jié)果證實(shí)了FSP1/LNPs光照組FSP1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)；圖3H的Western blot顯示，其蛋白水平降低57%。

圖3 FSP1/LNP的細(xì)胞毒性和FSP 1基因的沉默效應(yīng)。A）用各種制劑處理后CT 26細(xì)胞的細(xì)胞活力；B）進(jìn)行各種處理的CT 26細(xì)胞的乳酸脫氫酶（LDH）釋放；C）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估CT 26細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生；D）暴露于指定制劑的CT 26細(xì)胞的凋亡水平；E）凋亡水平的定量評(píng)估；F）接受指定處理的CT 26細(xì)胞的活染色和死染色；G）在指定處理后CT 26細(xì)胞中FSP 1的mRNA表達(dá)；H）不同處理后CT 26細(xì)胞內(nèi)FSP 1和GAPDH表達(dá)水平的Western印跡評(píng)估

（4）FSP 1/LNP引起的鐵凋亡和氧化損傷

由于光敏LNPs可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生并實(shí)現(xiàn)FSP1基因的沉默，該研究接下來(lái)探討了結(jié)腸癌細(xì)胞中的鐵凋亡和氧化損傷。圖4A-B的BODIPY-C11成像顯示，F(xiàn)SP1/LNPs光照組綠色熒光最強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著高于NC/LNPs光照或FSP1/LNPs無(wú)光照組；圖4C ELISA測(cè)定該組CoQ10含量升高，提示FSP1活性下降。圖4D指出，光照后兩種LNPs均降低胞內(nèi)GSH水平，其中FSP1/LNPs降幅最大。圖4E-F的γ-H2AX熒光顯示，F(xiàn)SP1/LNPs光照組核內(nèi)綠色信號(hào)最強(qiáng)，伴隨DAPI形態(tài)圓縮；圖4G的JC-1流式結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該組線粒體膜電位下降最顯著，圖4H的TEM觀察到線粒體嵴消失、碎裂。圖4I-J揭示，F(xiàn)SP1 siRNA僅抑制CT26增殖，對(duì)NIH 3T3無(wú)明顯影響；圖4K表明，無(wú)光照FSP1/LNPs在NIH 3T3中細(xì)胞存活率>90%。

圖4 FSP 1/LNP引起的鐵凋亡和氧化損傷。A）各種處理?xiàng)l件后CT 26細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化水平的CLSM圖像；B）氧化BODIPY-C11的綠色熒光定量分析；C）用指定制劑處理的CT 26細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)CoQ 10水平；D）CT 26細(xì)胞內(nèi)的GSH水平；E）CT 26細(xì)胞中γ-H2 AX水平的CLSM圖像；F）γ-H2 AX水平的定量分析；G）具有JC-1單體的CT 26細(xì)胞的百分比；H）正常和FSP 1/LNP（+）的橫截面TEM圖像；I）用NC siRNA或FSP 1 siRNA處理后NIH 3 T3細(xì)胞活力的評(píng)估；J）用NC siRNA或FSP 1 siRNA處理后CT 26細(xì)胞活力的評(píng)估

（5）FSP 1/LNP的ICD和DC成熟效應(yīng)

為了研究FSP1基因沉默和PDT對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的聯(lián)合作用，該研究對(duì)正常或FSP1/lnps處理的CT26細(xì)胞中提取的總RNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。圖5A轉(zhuǎn)錄組顯示FSP1/LNPs光照組較對(duì)照組上調(diào)1437個(gè)、下調(diào)1290個(gè)基因；圖5B列示差異基因：Egr1、Txnip、Btg2、Rnd1上調(diào)，Cp、Scd1、Sema5a下調(diào)，Gadd45g升高而Rhbdd1降低，Nrp2、Grem1、Fn1、Slit1下調(diào)。為了探討抗腫瘤免疫反應(yīng)。采用免疫熒光法測(cè)定高遷移率組盒1 (HMGB1)和鈣網(wǎng)蛋白(CRT)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。圖5C-D免疫原性細(xì)胞死亡檢測(cè)顯示，F(xiàn)SP1/LNPs光照組核內(nèi)HMGB1熒光強(qiáng)度顯著降低，表明其大量外釋?zhuān)粓D5E-F提示膜表面CRT熒光強(qiáng)度最高，證實(shí)免疫原性信號(hào)充分暴露。圖5I胞內(nèi)ATP水平下降40%，進(jìn)一步支持DAMPs釋放。圖5G-H BMDCs與處理后上清共培養(yǎng)結(jié)果顯示，CD80?CD86?雙陽(yáng)性成熟樹(shù)突狀細(xì)胞比例由22.37%激增至52.93%，標(biāo)志DC成熟及后續(xù)T細(xì)胞激活能力顯著增強(qiáng)。

圖5 FSP 1/LNP的ICD和DC成熟效應(yīng)。A）正常CT 26細(xì)胞和FSP 1/LNP（+）處理的CT 26細(xì)胞之間鑒定的總DEG的火山圖；B）描繪正常與FSP 1/LNP（+）處理的CT 26細(xì)胞中的特異性DEG的熱圖；C）CT 26細(xì)胞中HMGB 1表達(dá)的CLSM圖像；D）HMGB 1表達(dá)的定量分析；E）CT 26細(xì)胞中CRT表達(dá)的CLSM圖像；F）CRT表達(dá)的定量分析；G）與CT 26上清液孵育后BMDC成熟的流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估；H）成熟CD 80+細(xì)胞的定量分析；I）CT26細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)ATP水平的評(píng)估

（6）FSP 1/LNP的生物分布和腫瘤生長(zhǎng)抑制作用

為了研究光敏LNPs在BALB/c小鼠體內(nèi)的生物分布和抗腫瘤生長(zhǎng)作用，建立了CT26荷瘤模型。在系統(tǒng)給予游離光敏劑或FSP1/LNPs后，通過(guò)體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)確定其在不同時(shí)間點(diǎn)的生物分布行為。圖6A活體成像顯示，F(xiàn)SP1/LNPs在腫瘤部位的熒光信號(hào)于4 h達(dá)峰，且顯著高于游離藥物；圖6B離體成像證實(shí)其主要分布于腫瘤與肝臟；圖6C定量示腫瘤熒光強(qiáng)度為游離藥的1.75倍。圖6D-E顯示治療12 d后，F(xiàn)SP1/LNPs光照組腫瘤最?。粓D6F-G體積與重量曲線表明該組抑瘤效果最佳；圖6H體重監(jiān)測(cè)未見(jiàn)明顯變化，提示其生物安全性良好；圖7I腫瘤切片CRT免疫熒光顯示，F(xiàn)SP1/LNPs光照組膜CRT信號(hào)最高，顯著高于NC/LNPs光照組。

圖6 FSP 1/LNP的生物分布和腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。（A）游離Verteporfin和FSP 1/LNP的生物分布評(píng)價(jià)；B）治療后24 h腫瘤和器官的熒光成像；C）器官和腫瘤中熒光信號(hào)的定量評(píng)價(jià)；D）使用光敏LNP通過(guò)協(xié)同F(xiàn)SP 1基因沉默和ROS產(chǎn)生來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療方案；E）第12 d來(lái)自治療小鼠的腫瘤照片；F）評(píng)估接受各種治療的小鼠中的腫瘤體積；G）各組中第12 d的腫瘤重量;H）12 d內(nèi)小鼠的體重變化

（7）FSP 1/LNP的抗癌免疫應(yīng)答和遠(yuǎn)端腫瘤抑制作用

考慮到光敏LNPs可誘導(dǎo)鐵上沉和氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)ICD和DC成熟，提出其治療效果也可能通過(guò)重塑免疫抑制腫瘤微環(huán)境在體內(nèi)發(fā)揮結(jié)腸癌免疫治療作用。圖7A-B進(jìn)一步指出，引流淋巴結(jié)中CD45?MHC-II?CD11c?群體里的CD80?CD86?成熟DC比例由對(duì)照的10.51%增至NC/LNPs光照組的19.82%，再升至FSP1/LNPs光照組的24.57%。圖7C–I的雙側(cè)瘤模型結(jié)果表明，F(xiàn)SP1/LNPs光照組原發(fā)腫瘤與遠(yuǎn)端腫瘤均最小：腫瘤體積和重量均達(dá)最低值，且遠(yuǎn)端瘤的顯著抑制證實(shí)全身免疫激活。圖7J–L顯示，腫瘤內(nèi)CD45?CD3?CD4?FoxP3?Treg比例依次由對(duì)照13.45%、NC/LNPs光照6.6%降至FSP1/LNPs光照2.6%；圖7K–M的脾臟流式顯示，CD3?CD8?CD44?CD62L?效應(yīng)記憶T細(xì)胞比例由對(duì)照9.98%、NC/LNPs光照25.37%升至FSP1/LNPs光照38.74%。圖7N–O證實(shí)，原發(fā)與遠(yuǎn)端腫瘤中CD45?CD3?CD8?細(xì)胞毒性T細(xì)胞比例在FSP1/LNPs光照組均達(dá)到最高?？偟膩?lái)說(shuō)，這些雙側(cè)腫瘤模型的免疫表型結(jié)果表明，F(xiàn)SP1/LNPs可以重塑免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，并通過(guò)激活T細(xì)胞和協(xié)調(diào)抗癌免疫反應(yīng)來(lái)引發(fā)持久的腫瘤抑制。

圖7 FSP 1/LNP的抗癌免疫應(yīng)答和遠(yuǎn)端腫瘤抑制作用。A）腫瘤引流淋巴結(jié)中DC成熟的評(píng)估；B）CD 80 + CD 86+成熟DC的定量評(píng)估（；C）采用光敏LNP刺激全身抗腫瘤免疫的治療方案；D）小鼠中原發(fā)腫瘤體積的變化；E）遠(yuǎn)處腫瘤體積變化；F）第14 d原發(fā)腫瘤的照片;G）遠(yuǎn)端腫瘤的照片；H）第14d原發(fā)腫瘤重量；I）第14 d遠(yuǎn)端腫瘤重量；J）FoxP 3+的流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估原發(fā)性腫瘤內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；K）脾樣品中效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD 44 + CD 62 L-）的評(píng)估；L）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的FoxP 3+的定量結(jié)果；M）效應(yīng)記憶T細(xì)胞的定量；N）原發(fā)性腫瘤內(nèi)CD8+ T淋巴細(xì)胞的定量結(jié)果；O）遠(yuǎn)端腫瘤內(nèi)CD8 + T淋巴細(xì)胞的定量結(jié)果