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針對(duì)上述問題，四川大學(xué)華西醫(yī)院張暉教授設(shè)計(jì)了一種源自中草藥的自適應(yīng)刺激響應(yīng)型水凝膠，采用兩親性膠束PEG-S-S-PLGA來負(fù)載Pae，解決其水溶性差的問題，再將負(fù)載Pae的膠束(MIC@Pae)添加到OBPG水凝膠中，構(gòu)建了OBPG&MP水凝膠藥物遞送系統(tǒng)。注射到傷口后，能夠快速消除細(xì)菌并減輕氧化應(yīng)激，促進(jìn)皮膚修復(fù)環(huán)境的形成。隨后，慢性傷口中的活性氧(ROS)打破MIC@Pae中的二硫鍵，持續(xù)釋放白芍根提取物——芍藥苷(Pae)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化和新生血管形成，加速皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和膠原沉積，最終加速慢性傷口愈合。該文章于2024年04月30日以《A Multifunctional Herb-Derived Glycopeptide Hydrogel for Chronic Wound Healing》為題發(fā)表于《Small》（DOI：10.1002/smll.202400516）。

方案1. 多功能草藥衍生的糖肽 OBPG&MP 水凝膠在慢性傷口愈合中的設(shè)計(jì)和應(yīng)用示意圖

（1）材料合成與表征

通過¹H NMR對(duì)PEG-S-S-PLGA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，特征峰分別出現(xiàn)在3.6 ppm和1.2 ppm，歸屬于PEG基團(tuán)中的亞甲基和PLGA中的甲基，其他特征峰出現(xiàn)在3.1 ppm和2.7 ppm，說明PEG-S-S-PLGA結(jié)構(gòu)的成功合成。PEG-S-S-PLGA用于包裹疏水性藥物Pae，UV光譜顯示MIC@Pae中Pae的特征吸收峰（242 nm），表明藥物成功包裹，包封率為46.5%，粒徑和Zeta電位分析顯示載藥后電位升高，但粒徑無顯著變化。通過H₂O₂驗(yàn)證了其對(duì)氧化還原反應(yīng)的響應(yīng)性，顯示在ROS條件下，MIC@Pae的粒徑減小，Zeta電位升高，形貌發(fā)生變化，PDI值增加，說明成功制備了ROS響應(yīng)型膠束。PLY-GA通過酰胺縮合反應(yīng)合成，¹H NMR和FTIR證實(shí)了GA成功接枝，UV光譜顯示GA的特征峰，GA的取代度約為16.9%，OBSP通過BSP在NaIO4氧化下合成，¹HNMR和FTIR表明其結(jié)構(gòu)變化，成功制備了OBSP。

圖1. MIC@Pae、PLY-GA 和 OBSP 的表征。a）MIC、Pae MIC@Pae 的紫外-可見光譜；b，c）生理和高ROS的條件下 MIC@Pae 的代表性 TEM 圖像（比例尺：50 nm）；d，e）MIC、MIC@Pae、MIC@Pae的Zeta電位和平均粒徑；f，g）與 ROS 孵育后MIC@Pae的大小分布和 PDI 值的變化；h–j）PLY-GA 的合成路線、1H NMR波譜和FTIR波譜；k，l）OBSP 的1H NMR波譜和FTIR波譜

（2）水凝膠的制備與表征

本研究使用的糖肽OBPG水凝膠通過將等體積的OBSP溶液和PLY-GA溶液在室溫下混合制備，掃描電鏡（SEM）和元素映射顯示其均勻的多孔結(jié)構(gòu)，有利于藥物負(fù)載和細(xì)胞募集。隨后，在凝膠化前向水凝膠中加入濃縮的MIC@Pae溶液，形成了OBPG&MP藥物釋放系統(tǒng)。SEM圖像顯示MIC@Pae均勻分布在水凝膠骨架上，且元素映射與EDS分析證實(shí)了其均勻結(jié)構(gòu)。由于Schiff堿鍵的動(dòng)態(tài)可逆性和pH敏感性，OBPG&MP水凝膠展現(xiàn)了優(yōu)異的注射性、自愈合能力和響應(yīng)性。這些特性使其能夠適應(yīng)不規(guī)則傷口，并通過自愈合功能修復(fù)因運(yùn)動(dòng)引起的損傷，流變學(xué)測(cè)試進(jìn)一步證實(shí)了水凝膠的自修復(fù)能力及其內(nèi)部彈性網(wǎng)絡(luò)的形成。水凝膠還具有較好的粘附性，能夠穩(wěn)定附著在傷口上，為皮膚再生提供理想的微環(huán)境。在模擬生理?xiàng)l件下，水凝膠表現(xiàn)出良好的吸液能力，在12小時(shí)內(nèi)達(dá)到吸收平衡，48小時(shí)后溶脹比降低，表明水凝膠開始降解，降解行為的進(jìn)一步評(píng)估顯示，水凝膠在7天內(nèi)逐步降解，便于敷料的去除而不損傷新生組織。此外，OBPG&MP水凝膠具有pH和活性氧（ROS）響應(yīng)性，可通過酸性或ROS觸發(fā)智能藥物釋放機(jī)制，在酸性或ROS條件下Pae的釋放速率顯著提高，持續(xù)至少72小時(shí)。

圖2. 水凝膠的表征。a）OBPG 水凝膠的凝膠化；b，c）OBPG 和 OBPG&MP 水凝膠的 SEM 圖像（比例尺：100 μm）；d）OBPG&MP 水凝膠的 EDS 元素映射；e）OBPG&MP 水凝膠的注射性、自愈性和響應(yīng)能力的示意圖；f）OBPG&MP水凝膠注射的可視化；g）OBPG&MP 水凝膠自愈能力的可視化；h，i）水凝膠的流變特性；k）OBPG&MP 水凝膠的 pH響應(yīng)途徑和宏觀觀察；l）不同環(huán)境下OBPG &MP水凝膠的 Pae 釋放動(dòng)力學(xué)；m，n）OBPG&MP 水凝膠的溶脹和降解性能

（3）水凝膠的生物相容性和抗氧化性

通過細(xì)胞毒性和溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)估了OBPG&MP水凝膠的生物相容性，在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，使用小鼠成纖維細(xì)胞（L929）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）與水凝膠浸提液共培養(yǎng)3天，結(jié)果顯示大多數(shù)細(xì)胞保持正常的增殖狀態(tài)，且細(xì)胞存活率超過95%。溶血實(shí)驗(yàn)表明，OBPG&MP水凝膠的溶血率小于5%，符合生物材料的血液相容性標(biāo)準(zhǔn)。此外，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，水凝膠在促進(jìn)細(xì)胞遷移方面具有顯著效果，尤其在傷口愈合過程中表現(xiàn)出很大的潛力。抗氧化測(cè)試結(jié)果表明，該水凝膠能有效清除羥基自由基、超氧陰離子和過氧化氫，且在模擬的氧化應(yīng)激環(huán)境中，對(duì)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用顯著。這些特性使OBPG&MP水凝膠能夠加速傷口愈合，防止氧化損傷。

圖3. 水凝膠的生物相容性和抗氧化能力。a-c）L929 和 HUVEC 與水凝膠浸提液一起孵育的活/死染色和 CCK-8 測(cè)定（比例尺：50 μm）；d）水凝膠的血液相容性；e）LPS 激活的 L929 劃痕愈合率與水凝膠浸提液一起孵育；f）OBPG 和 MP 水凝膠的 ROS 清除能力示意圖；g-i）水凝膠對(duì)·OH─、O2?和 H2O2的清除率；j，k）DCFH-DA 指示劑檢測(cè)的水凝膠的細(xì)胞內(nèi) ROS 清除能力（比例尺：50 μm）

（4）水凝膠的抗菌活性

PLY在感染傷口中展現(xiàn)了廣譜抗菌活性，并且價(jià)格低廉，適合作為抗菌水凝膠的材料。本研究通過在PLY的側(cè)鏈上接枝GA，增強(qiáng)了水凝膠的生物功能。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLY-GA對(duì)常見慢性傷口病原菌金黃色葡萄球菌（S. aureus）和銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）的抗菌率分別為96.2%和94.0%。其抗菌機(jī)制依賴于靜電作用，正電荷的PLY-GA分子穿透負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞膜失去選擇性，細(xì)菌自溶死亡。此外，OBPG&MP水凝膠的抗菌性能也得到了多種表征驗(yàn)證。光密度法顯示，該水凝膠對(duì)S. aureus和P. aeruginosa的抗菌率分別為97.2%和97.8%，平板培養(yǎng)法和活/死細(xì)菌染色法也證實(shí)了其顯著的抗菌效果。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果表明，與細(xì)菌共孵育后，細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)受損，表現(xiàn)出凹陷和破裂，內(nèi)容物泄漏。這是由于細(xì)菌膜帶負(fù)電，而水凝膠中的-NH2在水中質(zhì)子化后帶正電，與細(xì)菌膜發(fā)生電荷相互作用，破壞其結(jié)構(gòu)?？傊?，OBPG&MP水凝膠表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，有助于促進(jìn)感染部位的傷口愈合。

圖4. 水凝膠的抗菌能力。a）OBPG&MP水凝膠抗菌機(jī)制示意圖；b，c）水凝膠的抑菌率；d）不同組 LB 平板上的細(xì)菌菌落；e）與水凝膠共培養(yǎng)的細(xì)菌的活/死染色（比例尺：20 μm）；f，g）不同組細(xì)菌的代表性 SEM 和 TEM 圖像（比例尺：200 nm，1 μm）

（5）水凝膠的免疫調(diào)節(jié)能力

巨噬細(xì)胞是局部和全身炎癥的主要調(diào)節(jié)者，并在傷口愈合中發(fā)揮不可或缺的作用。巨噬細(xì)胞的極化指的是在特定時(shí)間和位置激活巨噬細(xì)胞，它們具有足夠的可塑性以響應(yīng)不同的生物信號(hào)，極化為不同的表型。傷口修復(fù)中的巨噬細(xì)胞主要表現(xiàn)為兩種表型：促炎的M1型和抗炎的M2型，M1向M2的轉(zhuǎn)變對(duì)于傷口愈合至關(guān)重要，但在慢性傷口中經(jīng)常停滯，生物材料的生化特性可能會(huì)影響巨噬細(xì)胞的極化。本實(shí)驗(yàn)使用RAW 264.7細(xì)胞評(píng)估了OBPG&MP水凝膠對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示，OBPG水凝膠能夠減少M(fèi)1型標(biāo)志物iNOS的表達(dá)，增加M2型標(biāo)志物CD206的表達(dá)，具有抗炎作用并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化。此外，水凝膠還減少了促炎因子IL-6的表達(dá)，增加了抗炎因子IL-10的水平。通過抑制STAT3通路并激活STAT6通路，OBPG&MP水凝膠促進(jìn)了M1型向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，有助于減輕慢性傷口的炎癥并促進(jìn)愈合過程。這可能與水凝膠中添加的中藥成分BSP和Pae有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。

圖5. 水凝膠的免疫調(diào)節(jié)。a）不同組巨噬細(xì)胞極化的代表性免疫熒光染色圖像（M1：iNOS，M2：CD206，比例尺：100 μm）；b，c）用不同水凝膠處理后 iNOS 和 CD206 的相對(duì)mRNA表達(dá)；d）不同組中促炎細(xì)胞因子 IL-6 和抗炎細(xì)胞因子 IL-10 的代表性免疫熒光染色圖像（比例尺：100 μm）；e，f）用不同水凝膠處理后 IL-6 和 IL-10 的相對(duì)mRNA表達(dá)；g）OBPG&MP 水凝膠的免疫調(diào)節(jié)和抗炎機(jī)制示意圖；h） WB檢測(cè)的不同組中STAT3、p-STAT3、STAT6、p-STAT6、iNOS、IL-6、CD206和IL-10的表達(dá)

（6）水凝膠的促血管化能力

慢性傷口無法愈合的主要原因之一是通過血管生成再生微血管系統(tǒng)的能力降低，促進(jìn)新生血管生成可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重塑并增強(qiáng)皮膚再生。中藥及其活性成分因其在治療缺血性疾病中的悠久歷史，已被廣泛研究其潛在的促血管生成特性，Pae是芍藥中的主要活性成分，已在內(nèi)皮細(xì)胞和血管功能障礙的斑馬魚模型中顯示出血管生成特性。研究表明，Pae可以增強(qiáng)血管生長(zhǎng)因子的分泌，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，并在缺血性中風(fēng)大鼠模型中顯著緩解腦梗死，增加腦血管密度。同時(shí)，BSP（黃芪多糖）通過上調(diào)VEGF表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞遷移，加速傷口愈合。因此，推測(cè)OBPG水凝膠中的BSP和Pae的持續(xù)釋放可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子來刺激血管生成。在傷口愈合過程中，血管生成與血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子（如VEGF和HIF-1α）密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OBPG&MP組顯著提高了VEGF和HIF-1α的水平，并通過管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)水凝膠促進(jìn)了血管新生。這些結(jié)果表明，OBPG&MP水凝膠顯著提高了血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)了新生血管形成，有助于慢性傷口的血管再生和內(nèi)皮修復(fù)。

圖6. 水凝膠的促血管化能力。a）OBPG &MP 水凝膠血管生成機(jī)制的示意圖；b）不同組中生長(zhǎng)因子 VEGF 和 HIF-1α 的代表性免疫熒光染色圖像（比例尺：100 μm）；c–e）WB 和 PCR 檢測(cè)不同組 VEGF 和 HIF-1α 的表達(dá)；f-h）不同組中的代表性試管形成圖像和定量試管長(zhǎng)度和強(qiáng)度（比例尺：100 μm）

（7）水凝膠促進(jìn)感染慢性傷口愈合

體外研究表明，OBPG&MP水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性、抗菌性、清除活性氧（ROS）的能力、免疫調(diào)節(jié)功能以及促進(jìn)血管生成的特性。為了評(píng)估水凝膠在體內(nèi)促進(jìn)慢性傷口愈合的效果，研究采用了金黃色葡萄球菌感染的糖尿病大鼠皮膚缺損模型。通過鏈脲佐菌素（STZ）注射誘導(dǎo)糖尿病模型，并在糖尿病模型中制作全層皮膚損傷，感染金黃色葡萄球菌以模擬感染性傷口。實(shí)驗(yàn)使用了OBPG&MP水凝膠、OBPG水凝膠、MIC@Pae溶液、Hydrosorb標(biāo)準(zhǔn)敷料等進(jìn)行對(duì)比治療。結(jié)果顯示，OBPG&MP水凝膠組的傷口愈合效率顯著優(yōu)于其他組，在第7天，OBPG&MP水凝膠組的傷口收縮率為75.2%，顯著高于對(duì)照組的36.2%；第14天時(shí)，OBPG&MP水凝膠組的傷口幾乎完全愈合，收縮率為98.1%，超過了其他對(duì)照組。此外，HE染色顯示，各組內(nèi)臟組織形態(tài)未見顯著差異，證明OBPG&MP水凝膠具有良好的生物相容性。進(jìn)一步研究表明，OBPG&MP水凝膠具有顯著的抗菌和抗氧化能力，有效減少了傷口微環(huán)境中的細(xì)菌和氧化應(yīng)激水平。H&E和Masson染色結(jié)果顯示，OBPG&MP水凝膠在第7天時(shí)促進(jìn)了傷口邊緣收縮，并減少了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；第14天時(shí)，水凝膠組已實(shí)現(xiàn)完全的重新上皮化，并且炎癥細(xì)胞顯著減少，膠原沉積密集且有序，表皮和真皮組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)良好。這些結(jié)果表明，OBPG&MP水凝膠通過加速傷口收縮、重新上皮化和膠原沉積，促進(jìn)了慢性傷口的修復(fù)。

圖7. 水凝膠促進(jìn)慢性傷口愈合的作用。a）處理程序示意圖；b）不同治療后傷口愈合痕跡的代表性圖像（比例尺：5 mm）；c）不同治療的傷口收縮率；d，e）水凝膠的體內(nèi)抗菌能力；f）各組DHE 的代表性免疫熒光染色圖像（比例尺：100 μm）；g-i） 第 14 天不同組再生皮膚中傷口邊緣、毛囊和膠原蛋白沉積的定量；j，k）通過 HE 和 Masson 染色對(duì)再生皮膚進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估（傷口邊緣：藍(lán)色箭頭，血管：黃色箭頭，毛囊：綠色箭頭，比例尺：2 和 200 μm）

（8）免疫熒光染色

M1向M2巨噬細(xì)胞的逐步轉(zhuǎn)變標(biāo)志著炎癥向增殖階段的過渡，結(jié)合OBPG&MP水凝膠在體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞向M2極化的結(jié)果，研究進(jìn)一步調(diào)查了傷口中巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)和炎癥程度。雙重免疫熒光染色顯示，水凝膠組中M1巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，M2巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，表明炎癥減輕、抗炎特性增強(qiáng)。此外，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，OBPG&MP水凝膠顯著降低了促炎細(xì)胞因子IL-6的水平，同時(shí)增加了抗炎因子IL-10的表達(dá)。研究還表明，血管生成對(duì)于慢性傷口愈合至關(guān)重要。通過雙重免疫熒光染色分析，水凝膠組顯示出更多成熟的大血管，表明其具有良好的促血管生成能力。ELISA結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了這些發(fā)現(xiàn)，表明OBPG&MP水凝膠在炎癥因子和血管標(biāo)志物表達(dá)上具有顯著影響。此外，水凝膠促進(jìn)了I型和III型膠原蛋白的沉積與重塑，提高了傷口組織的強(qiáng)度和完整性。

圖8. OBPG&MP 水凝膠對(duì)傷口愈合的免疫熒光染色。a）不同組巨噬細(xì)胞極化的免疫熒光染色 （M1：iNOS，M2：CD206，比例尺：100 μm）；b，c）IL-6和IL-10的代表性免疫組織化學(xué)染色圖像（比例尺：100 μm）；d）不同組中新形成的血管生物標(biāo)志物 CD31 和 α-SMA 的免疫熒光染色（比例尺：100 μm）；e）不同組膠原蛋白 I/III 的免疫熒光染色（比例尺：100 μm）；f-i） 第 7 天通過 ELISA 評(píng)估炎癥因子 IL-6 和 IL-10 以及血管生物標(biāo)志物 VEGF 和 CD31 的表達(dá)水平