亚洲强入中文字幕乱码_国产剧爱丫爱丫免费观看_成人激情视频网_4480yy私人影院亚洲_有码+日韩+在线观看_美女任你摸在线视频网站_中文字幕日韩精品内射_亚洲sss777无码整片在线播放_中文字幕2019永久免费视频_男生插曲女生app下载迷你世界

針對上述問題，中國醫(yī)學科學院李穩(wěn)團隊開發(fā)了一種 pH 響應型光動力探針 TI，并將其與具有 ROS 反應的一氧化碳（CO）供體組裝在一起，然后封裝在基于 HA 的微針貼片中，最終形成了治療微針平臺。微針結構增強了分子探針和一氧化碳供體對傷口感染部位生物膜的機械滲透。當遇到傷口的酸性微環(huán)境時，TI 會發(fā)生動態(tài)分子結構變化，從而產生顯著的近紅外熒光輸出，用于檢測感染并評估其嚴重程度。與此同時，納米探針還能釋放其產生 ROS 的潛能，這不僅能通過氧化損傷直接消滅細菌，還能觸發(fā) CO 的釋放，用于輔助氣體治療?？傊稍\斷和治療微針平臺為解決傷口感染和減輕抗生素耐藥性帶來的挑戰(zhàn)提供了一種前景廣闊的方法，為感染護理管理領域帶來了重大希望。該文章于2024年12月12日以《Bacterial Microenvironment-Responsive Microneedle Patches for Real-Time Monitoring and Synergistic Eradication of Infection》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202414834）。

圖1 研究示意圖

（1）pH觸發(fā)的結構可變分子TI的合成及其光物理特性研究

圖2（a）合成路徑示意圖展示了目標分子（TI）的合成步驟及關鍵中間體的形成。圖2（b）結構轉化機制為 TI 在不同 pH 條件下的結構變化示意圖：堿性條件下 TI 呈閉環(huán)結構，酸性條件下環(huán)打開形成具有強電子受體特性的 D-A 結構。圖2（c）為不同 pH 條件下 TI 的 NMR 譜圖，酸性環(huán)境下出現新峰，表明分子結構變化。圖2（d）吸收光譜展示了不同 pH 值下 TI 的 UV-Vis 吸收光譜，pH 下降時 550 nm 處吸收峰增強，表明結構轉變。圖2（e）通過 550 nm 處吸光度變化曲線計算出 TI 的 pKa 值約為 6.39，適用于檢測弱酸性感染環(huán)境。圖2（f）熒光光譜顯示 TI 的熒光強度隨 pH 下降而增強，表現出顯著的 “off-to-on” NIR 熒光響應。圖2（g）熒光成像顯示不同 pH 條件下 TI 的熒光圖像，酸性環(huán)境下熒光信號顯著增強。圖2（h）TI 在 pH 8 和 pH 3 之間循環(huán) 5 次后，吸收信號無明顯衰減，證明其可逆性和穩(wěn)定性。圖2（i）光照下，TIOH 的吸收幾乎不變，而 ICG 快速衰減，表明 TIOH 具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性。圖2（j）選擇性測試顯示 TI 在多種生物相關物質存在下對 pH 具有高選擇性，受干擾小。整體來看，TI 具有優(yōu)異的 pH 依賴性熒光響應、良好的穩(wěn)定性和高選擇性，是理想的感染診療探針。

圖2. pH觸發(fā)的結構可變分子TI的合成及其光物理特性研究。（a）TI的合成路線；（b）TI的pH響應結構轉變；（c）TI在酸性和堿性條件下的1H NMR；（d）TI在不同pH值下的吸收率和溶液顏色；（e）根據滴定擬合曲線得到的pKa；（f）TI在不同pH值下的熒光光譜；（h）TI分子在pH 3（紅圈）和pH 8（藍圈）之間切換五個周期時的可逆吸光度；（i）ICG和TIOH在白光（0.1 W cm?2）照射8分鐘后的紫外吸收（I???）變化；（j）TI在不同生物干擾物存在下的熒光變化

（2）TI在不同pH條件下的光動力學效應研究

圖3a展示了在酸性條件下，TI分子在光照下產生活性氧（ROS）的能力。隨著光照時間增加，DPBF的吸光度在412 nm處顯著下降，表明ROS生成。圖3b顯示不同pH條件下，TI和DPBF混合物在光照下的吸光度變化，只有在酸性條件（pH 5）下，TI才能有效產生ROS。圖3c展示了在酸性條件下，TI分子在光照下產生單線態(tài)氧（1O?）的能力，ABDA的吸光度在光照下迅速下降，表明1O?生成。圖3d顯示在酸性條件下，TI分子在光照下產生羥基自由基（?OH）的能力，TMB的吸光度在光照下顯著增加，確認了?OH生成。圖3e通過電子自旋共振（ESR）光譜確認了TI分子在光照下產生1O?和?O??的能力，使用TEMP和DMPO作為自旋捕獲劑，分別檢測到了1O?和?O??的特征信號。圖3f展示了TI和酸激活的TIOH的能級結構，理論計算表明，酸激活的TIOH具有更小的能帶隙（2.61 eV），有助于更高效的系間竄躍（ISC）過程，從而增強ROS的生成能力。這些圖表共同說明了TI分子在酸性條件下具有顯著的ROS生成能力，包括1O?和?OH，并且這種能力可以通過光照觸發(fā)。此外，酸激活的TIOH由于其更小的能帶隙，表現出更高效的ISC過程，從而增強了ROS的生成。這些特性使TI成為一個有潛力的光動力治療（PDT）候選物，用于精確和高效地治療感染。

圖3. TI在不同pH條件下的光動力學效應研究。（a）在酸性pH值（pH = 5）下，白光照射（0.1 W cm?2）下有TI存在時，DPBF的吸光度變化；（e）通過電子自旋共振（ESR）光譜證實TI的I型和II型光動力治療（PDT）效應；（f）計算出的TI（原始形式）和TIOH（酸性形式）的分子幾何形狀、最高占據分子軌道（HOMO）、最低未占據分子軌道（LUMO）以及能級

（3）TI納米顆粒的光物理特性和生物相容性研究

圖4a展示了TI納米顆粒（NPs）的粒徑分布和透射電子顯微鏡（TEM）圖像。動態(tài)光散射（DLS）數據顯示平均粒徑為126 nm，多分散指數（PDI）為0.15，TEM圖像確認了顆粒的均勻球形結構，平均直徑約為110 nm。圖4b顯示了不同pH值下TI納米顆粒的紫外-可見吸收光譜。隨著pH值的降低，TI納米顆粒在342 nm處的吸收強度逐漸減弱，同時在550 nm處出現了新的吸收峰，表明其具有pH響應的光物理特性。圖4c展示了在酸性條件下，TI納米顆粒在光照下產生活性氧（ROS）的能力。隨著光照時間的增加，DPBF的吸光度逐漸降低，表明TI納米顆粒能夠有效產生ROS。圖4d顯示了在酸性條件下，TI納米顆粒在光照下釋放一氧化碳（CO）的能力。隨著光照時間的延長，CO探針的熒光強度顯著增強，表明TI納米顆粒能夠控制釋放CO。圖4e展示了TI納米顆粒對L929小鼠成纖維細胞的細胞活力影響。結果表明，在不同濃度下，TI納米顆粒對細胞的毒性很低，即使在光照條件下，細胞存活率也保持在86%以上。圖4f通過細胞骨架染色實驗，展示了TI納米顆粒對細胞結構的影響。結果顯示，處理后的細胞結構沒有顯著變化，表明TI納米顆粒對細胞結構影響較小。圖4g通過活/死細胞共染色實驗，展示了TI納米顆粒對細胞存活率的影響。結果顯示，處理后的細胞主要顯示綠色熒光（活細胞），紅色熒光（死細胞）很少，表明TI納米顆粒對細胞的毒性很低。這些圖表共同說明了TI納米顆粒具有良好的生物相容性、pH響應的光物理特性以及在酸性條件下產生ROS和釋放CO的能力，使其成為一種有潛力的抗菌納米劑。

圖4. TI納米顆粒的光物理特性和生物相容性研究。（a）TI NPs的DLS和TEM分析；（b）不同pH值下TI NPs的吸光度；（c）在酸性pH值下，DPBF暴露于TICO NPs +白光（0.1 W cm?2）下的吸光度變化；（d）CO探針在其特征峰值515 nm處的熒光強度，表明不同體系中CO的釋放水平；（f）細胞骨架染色；（g）L929細胞在不同處理下的活/死染色，比例尺為200 μm

（4）TICO納米顆粒對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力評估

圖5a和5b展示了在黑暗和光照條件下，不同處理（PBS、CO NPs、TI NPs、TiCO NPs）對金黃色葡萄球菌（S. aureus）和大腸桿菌（E. coli）在瓊脂平板上生長的影響?？梢杂^察到，只有TiCO NPs在光照條件下顯著抑制了細菌的生長。圖5c顯示了不同處理條件下，S. aureus和E. coli的菌落形成單位（CFU/mL）的對數值。結果表明，TiCO NPs在光照條件下對兩種細菌都有很強的殺菌效果，殺菌效率分別達到約98.3%和99.9%。圖5d和5e通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察了不同處理條件下細菌的形態(tài)變化?？梢钥吹?，經過TiCO NPs處理并在光照條件下的細菌細胞壁受到嚴重損傷，出現了廣泛的破裂和塌陷，而單獨使用TiCO NPs或光照處理的細菌結構相對完整。圖5f和5g通過活/死細胞共染色實驗，展示了不同處理條件下細菌的存活情況。使用Syto9（綠色熒光）標記活細胞，使用PI（紅色熒光）標記死細胞。結果表明，TiCO NPs在光照條件下處理的細菌主要顯示紅色熒光，表明其具有很高的殺菌效果。綜合這些結果，可以看出TiCO納米顆粒在光照條件下對S. aureus和E. coli都表現出顯著的殺菌效果。這種效果主要歸因于光動力療法（PDT）和一氧化碳（CO）的協(xié)同作用，它們共同破壞細菌的細胞壁和細胞膜，最終導致細菌細胞膜的收縮甚至破裂。這些發(fā)現為TiCO納米顆粒作為一種有效的抗菌劑提供了有力的證據。

圖5. TICO納米顆粒對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力評估。（a）不同處理后平板上金黃色葡萄球菌的代表性照片；（b）不同處理后平板上大腸桿菌的代表性照片；（d）不同處理后金黃色葡萄球菌的代表性掃描電鏡圖像（刻度線為2微米）；（e）不同處理后大腸桿菌的代表性掃描電鏡圖像（刻度線為2微米）；（f）不同組別金黃色葡萄球菌的活（綠色熒光）/死（紅色熒光）染色圖像，比例尺為100微米；（g）不同組別大腸桿菌的活（綠色熒光）/死（紅色熒光）染色圖像，比例尺為100微米。光照組的樣品在白光（0.1 W cm?2）下照射10分鐘

（5）TICO@MN貼片的制備及其機械性能和生物相容性研究

圖6a展示了微針（MN）貼片的制備過程。首先，將TiCO納米顆粒與高分子量透明質酸（HMHA）混合形成預水凝膠溶液，然后倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，經過真空脫氣和干燥。接著，在微針表面涂覆低分子量透明質酸（LMHA），離心形成獨立層，最后干燥后從模具中剝離。圖6b和6c通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察了微針的形態(tài)?？梢钥吹剑苽涞腡iCO@MN呈現出有序排列的10×10尖頂金字塔形微針，每個微針的高度為1000 μm，底部寬度為500 μm，中心間距為550 μm。圖6d展示了微針的分離過程。通過在微針中加載羅丹明B（RhB）染料，并將微針貼片浸入PBS溶液中，觀察微針與背襯層的分離情況。圖6e通過光學顯微鏡實時觀察微針在接觸水溶液后的分離狀態(tài)。結果表明，微針在接觸水溶液后迅速從背襯層分離，2分鐘內完成分離。圖6f展示了TiCO@MN的機械強度測試結果。通過壓縮測試，TiCO@MN表現出與透明質酸微針（HA MN）相似的機械強度，每個微針的壓縮力約為2.3 N，足以穿透角質層屏障。圖6g展示了TiCO@MN在新鮮豬皮上的穿透能力。通過施加拇指壓力，微針貼片可以輕松插入皮膚，留下清晰整齊的針孔，表明其優(yōu)異的皮膚穿透能力。圖6h通過蘇木精和伊紅（H&E）染色進一步確認了微針穿透角質層并進入表皮層，穿透深度約為150 μm。圖6i展示了TiCO@MN的細胞相容性測試結果。通過CCK8法測定細胞活力，結果表明TiCO@MN具有較高的細胞相容性。綜上所述，TiCO@MN貼片通過結合機械穿透和控制釋放的優(yōu)勢，具有很好的潛力用于按需經皮感染管理。

圖6. TICO@MN貼片的制備及其機械性能和生物相容性研究。（a）TICO@MN貼片的制備過程示意圖：將TICO NPs與高分子量透明質酸（HMHA）溶液混合后倒入PDMS模具中，反復真空脫氣和干燥；（b）TICO@MN的光學圖像；（c）TICO@MN的掃描電鏡圖像；（d）加載了羅丹明B（RhB）的MN貼片的光學圖像；（e）光學圖像顯示MN主體在PBS中培養(yǎng)一段時間后與背襯層的分離情況；（f）HA MN和TICO@MN貼片機械壓縮強度的測量；（g）小鼠皮膚貼上含RhB的MN貼片后的代表性照片和熒光圖像；（h）經TICO@MN處理后的小鼠皮膚蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像；（i）采用CCK-8法評估TICO@MN在光照下對L929小鼠成纖維細胞的細胞毒性

（6）TICO@MN貼片的pH響應傳感和抗菌性能研究

圖7a展示了在不同pH值條件下，TiCO納米顆粒在凝膠中的熒光強度。結果表明，在酸性環(huán)境中（pH 3-5），TiCO納米顆粒顯示出較強的近紅外（NIR）發(fā)射，而在堿性或中性環(huán)境中（pH 6-9），熒光強度較弱。這表明TiCO納米顆粒具有良好的pH響應能力。圖7b展示了不同處理條件下，金黃色葡萄球菌（S. aureus）生物膜在結晶紫染色后的生物量?？梢钥吹?，TiCO@MN在光照條件下處理的生物膜生物量顯著減少，表明其具有很好的抗生物膜效果。圖7c通過結晶紫染色定量分析了不同處理條件下生物膜的生物量。結果顯示，TiCO@MN在光照條件下處理的生物膜生物量減少了約60%，顯著高于其他處理組。圖7d通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）對生物膜中的活細菌進行3D重建染色?？梢钥吹?，TiCO@MN在光照條件下處理的生物膜中活細菌顯著減少，綠色熒光較弱。圖7e定量分析了不同處理條件下生物膜中活細菌的比例。結果顯示，TiCO@MN在光照條件下處理的生物膜中活細菌比例僅為約9.7%，顯著低于其他處理組。綜上所述，TiCO@MN貼片在光照條件下對金黃色葡萄球菌生物膜表現出優(yōu)異的破壞和殺菌效果，主要歸因于光動力療法（PDT）和一氧化碳（CO）氣體療法的協(xié)同作用。這些結果表明，TiCO@MN貼片在抗感染治療中具有良好的應用前景，特別是在對抗生物膜感染方面。

圖7. TICO@MN貼片的pH響應傳感和抗菌性能研究。（a）在IVIS（活體成像系統(tǒng)）下觀察到的TICO@MN貼片應用于不同pH值凝膠的近紅外熒光圖像；（b）不同處理下，通過水晶紫染色的生物膜的代表性照片；（d）不同處理后，用SYTO9染色的金黃色葡萄球菌（SA）生物膜的三維共聚焦圖像，比例尺為500 μm；（e）根據（d）中描述的染色圖像分析，對不同組SA生物膜內細菌存活率進行定量評估，數據以平均值±標準差（SD）表示（n = 3個獨立實驗重復）。光照組的樣品在白光（0.1 W cm?2）下照射10分鐘

（7）TICO@MN在體內監(jiān)測感染部位pH變化的能力評估

圖8a展示了在小鼠感染模型中實時監(jiān)測pH變化的實驗流程。首先，在BALB/c小鼠的背部皮膚上創(chuàng)建一個直徑為8毫米的圓形傷口，然后接種金黃色葡萄球菌（S. aureus）懸液以誘導感染。在細菌接種后的2、6、12和24小時時間點，將TiCO@MN貼片植入感染傷口中，以評估其監(jiān)測感染微環(huán)境的能力。圖8b展示了在不同時間點（0、2、6、12、24小時）感染后，TiCO@MN貼片在小鼠傷口部位的熒光成像?？梢钥吹剑S著感染的進展，TiCO@MN貼片發(fā)出的紅色熒光信號逐漸增強，特別是在感染后12小時達到峰值。圖8c定量分析了不同時間點（0、2、6、12、24小時）TiCO@MN貼片的熒光強度。結果表明，感染后12小時的熒光強度顯著高于其他時間點，表明TiCO@MN貼片能夠有效地監(jiān)測感染的進展。圖8d展示了在不同感染嚴重程度（1×10^6、1×10^7、1×10^8 CFU/mL）下，TiCO@MN貼片在小鼠傷口部位的熒光成像?？梢钥吹剑跏技毦鷿舛仍礁?，感染部位的近紅外（NIR）熒光信號越強。圖8e定量分析了不同感染嚴重程度下TiCO@MN貼片的熒光強度。結果表明，初始細菌濃度越高，熒光強度越大，表明TiCO@MN貼片能夠區(qū)分不同感染嚴重程度。綜上所述，TiCO@MN貼片在體內實驗中表現出優(yōu)異的pH響應特性，能夠有效地監(jiān)測感染微環(huán)境的pH變化，并區(qū)分不同感染嚴重程度。這些結果表明，TiCO@MN貼片在實時監(jiān)測感染進展和評估感染嚴重程度方面具有顯著的潛力。

圖8. TICO@MN在體內監(jiān)測感染部位pH變化的能力評估。（a）利用TICO@MN制作細菌傷口感染模型并進行感染成像的過程示意圖；（b）TICO@MN處理的傷口在細菌接種后不同時間點的代表性IVIS（活體成像系統(tǒng)）圖像；（d）TICO@MN處理過的不同嚴重程度傷口的代表性IVIS圖像，這些傷口是由不同細菌負荷的挑戰(zhàn)傷口誘發(fā)的；（e）基于（d）中的熒光圖像，對感染部位熒光強度的相應量化分析

（8）TICO@MN在小鼠皮下感染模型中的抗菌和傷口愈合能力評估

圖9a展示了小鼠皮下感染模型的實驗流程。首先在小鼠背部皮膚上創(chuàng)建傷口，然后接種金黃色葡萄球菌（S. aureus）以誘導感染。在感染12小時后，將感染的小鼠隨機分為六組，分別進行不同的處理：1）PBS，2）僅光照，3）TiCO@MN，4）Ti@MN + 光照，5）TiCO NPs + 光照，或6）TiCO@MN + 光照。在涉及光照治療的情況下，小鼠的傷口在給藥后暴露于強度為0.1 W/cm2的白光下10分鐘。圖9b展示了不同處理組在治療期間傷口愈合的進展情況?？梢钥吹?，TiCO@MN + 光照組的傷口愈合速度最快，愈合效果最好。圖9c定量分析了不同處理組的傷口閉合率。結果表明，TiCO@MN + 光照組的傷口閉合率最高，達到約87%，顯著高于其他組。圖9d通過H&E染色對第七天的傷口組織進行組織學檢查?？梢钥吹?，TiCO@MN + 光照組的炎癥反應顯著減少，傷口感染幾乎完全消退，伴有成纖維細胞和新形成的上皮結構。圖9e展示了不同處理組的傷口細菌菌落計數?？梢钥吹?，TiCO@MN + 光照組的細菌菌落數顯著減少，表明其具有優(yōu)異的殺菌效果。圖9f定量分析了不同處理組的傷口細菌菌落數。結果表明，TiCO@MN + 光照組的細菌數量減少了96.3%，顯著高于其他組。圖9g通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）分析了感染組織中IL-6和TNF-α的水平?？梢钥吹?，TiCO@MN + 光照組的IL-6和TNF-α水平顯著低于其他組，表明其能夠有效抑制炎癥反應。圖h定量分析了不同處理組的IL-6水平。結果表明，TiCO@MN + 光照組的IL-6水平最低，進一步證實了其抗炎效果。

綜上所述，TiCO@MN貼片在小鼠皮下感染模型中表現出優(yōu)異的抗菌和促進傷口愈合的能力。TiCO@MN + 光照組不僅能夠有效清除感染，還能夠調節(jié)局部免疫環(huán)境，促進組織再生。這些結果證實了TiCO@MN貼片在感染成像和抗菌治療中的潛力和良好的生物安全性。

圖9. TICO@MN在小鼠皮下感染模型中的抗菌和傷口愈合能力評估。（a）TICO@MN體內抗菌和傷口愈合能力評估程序的示意圖；（b）不同時間點小鼠傷口的代表性照片，經過不同處理后；（c）不同組別在不同時間點傷口愈合率的定量分析；（d）第7天不同組別傷口組織的代表性蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像，黃色箭頭表示炎性細胞浸潤；（e）不同組別傷口組織細菌培養(yǎng)板的代表性照片；（f）與（e）中細菌培養(yǎng)板結果相對應的不同組別CFU（菌落形成單位）計數定量分析；（g）不同處理后小鼠傷口內TNF-α水平的ELISA分析；（h）不同處理后小鼠傷口內IL-6水平的ELISA分析。數據以平均值±標準差（SD）表示（n = 3只小鼠）。光照組樣品在白光（0.1 W cm?2）下照射10分鐘