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針對上述問題，四川大學(xué)顧志鵬團(tuán)隊(duì)為解決血友病性關(guān)節(jié)病治療難題，利用植物多酚、鐵螯合劑和α-硫辛酸一鍋法構(gòu)建了一種具有清除ROS和鐵離子、保護(hù)軟骨功能的注射型水凝膠。該水凝膠由低成本、臨床可用成分構(gòu)成，具備良好的生物相容性、抗炎抗氧化及耐磨性。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示其可緩解HA病理過程、改善關(guān)節(jié)功能，具備良好應(yīng)用前景。該文章于2025年04月01日以《Robust Injectable Hydrogels for Hemophilic Arthropathy via Anti-Inflammation, Iron Removal and Cartilage Protection》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》上。（DOI: 10.1002/adfm.202500271）

（1）可注射水凝膠的制備與表征

研究通過一鍋法組裝三種商用小分子制備了多功能可注射水凝膠用于HA治療。其中LA加熱開環(huán)聚合后可與螯合模塊和抗氧化模塊形成多種相互作用（圖1a）；選用EGCG和去鐵胺（DFO）。通過優(yōu)化DFO和EGCG濃度獲得凝膠相圖，結(jié)果顯示DFO濃度升高促進(jìn)凝膠化，而高濃度EGCG降低凝膠概率（圖1b）。采用DFO和EGCG制備的1 mg/mL可注射水凝膠SEM和能譜分析顯示其具有典型多孔結(jié)構(gòu)且元素分布均勻。FT-IR證實(shí)EGCG與LA通過多酚硫自由基親核作用成功交聯(lián)（圖1c）。XPS分析顯示PLED水凝膠的S 2p譜含二硫鍵（164.6 eV）、脂肪硫（163.0 eV）和硫酚鍵（163.5 eV）三個(gè)特征峰（圖1d），表明EGCG酚基團(tuán)在交聯(lián)中起關(guān)鍵作用。分子動力學(xué)模擬顯示PLED結(jié)構(gòu)的范德華相互作用能最高（-85204.55 kJ/mol），穩(wěn)定性最佳（圖1e）。流變學(xué)測試表明水凝膠儲能模量高于損耗模量，具有良好彈性（圖1f）。其剪切稀化特性（圖1h）和自修復(fù)性能（圖1g）源于分子網(wǎng)絡(luò)中的氫鍵、動態(tài)二硫鍵和配位鍵，這些特性賦予材料優(yōu)異的可注射性和臨床適用性。

圖1 可注射水凝膠的制備與表征。（a）可注射水凝膠的主要成分及制備工藝；（b）可注射水凝膠的凝膠化相圖；（c）PLED水凝膠的FT-IR光譜；（d）PLED水凝膠的XPS表征；（e）PLED水凝膠各組分間物理相互作用能的分子模擬：I. DFO-DFO，II. LA/EGCG-LA/EGCG，III. LA/EGCG-DFO；（f）PLED水凝膠的流變測試結(jié)果；（g）PLED水凝膠的觸變行為；（h）PLED水凝膠的剪切稀化

（2）水凝膠的多功能性

研究開發(fā)的多功能PLED水凝膠在治療血友病性關(guān)節(jié)?。℉A）方面展現(xiàn)出優(yōu)異的綜合性能（圖2a）。在鐵清除能力方面，通過血紅蛋白氧化和菲啰啉比色法評估發(fā)現(xiàn)，加入亞鐵離子后溶液顏色由鮮紅色變?yōu)樽丶t色（圖2b）。光譜分析顯示PLED水凝膠能有效維持血紅蛋白在542 nm和577 nm處的特征吸收峰（圖2c），其保護(hù)效果顯著優(yōu)于不含EGCG的PLD水凝膠（圖2d,e）。進(jìn)一步的定量測試表明，PLED水凝膠對Fe2?的螯合能力達(dá)到83.3%（圖2f,g），證實(shí)了其良好的鐵清除能力。在抗氧化性能方面，DPPH和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)顯示，PLED水凝膠處理30分鐘后可使紫色DPPH溶液和藍(lán)色ABTS溶液褪色為淡黃色（圖2h,i），清除率分別達(dá)到80.5%和94.5%。值得注意的是，雖然DFO本身的自由基清除能力有限，但EGCG的加入顯著提升了水凝膠的整體抗氧化性能。潤滑性能測試模擬了四種不同的軟/軟接觸摩擦副（圖2j）。結(jié)果顯示PLED水凝膠與天然軟骨間的摩擦系數(shù)為0.046lbf/lbf，與天然軟骨間的摩擦系數(shù)（0.037lbf/lbf）非常接近（圖2k）。這種優(yōu)異的潤滑性能源于其獨(dú)特的液體潤滑機(jī)制，在負(fù)載下能形成有效的潤滑層。粘附性能評估采用牛膝關(guān)節(jié)模型，實(shí)驗(yàn)證明PLED水凝膠能在關(guān)節(jié)模擬液中保持10分鐘以上的穩(wěn)定粘附（圖2l）。與易碎裂的透明質(zhì)酸水凝膠相比，PLED水凝膠在反復(fù)關(guān)節(jié)運(yùn)動模擬后仍能均勻分布在軟骨表面（圖2m），這歸功于其多級相互作用機(jī)制。此外，該水凝膠還展現(xiàn)出良好的材料表面適應(yīng)性，為其臨床應(yīng)用提供了更多可能性。

圖2 水凝膠的功能特性。（a）多功能可注射水凝膠的示意圖；（b–e）可注射水凝膠對血紅蛋白的保護(hù)作用；（f）鐵離子螯合、DPPH自由基清除、ABTS自由基清除溶液的顏色變化圖；（g）鐵清除能力；（h）DPPH自由基清除性能；（i）ABTS自由基清除性能；（j）簡化示意圖，說明四種不同的摩擦對；（k）可注射水凝膠與軟骨之間的摩擦系數(shù)結(jié)果；（l）可注射水凝膠在模擬關(guān)節(jié)炎模型中的粘附效果；（m）關(guān)節(jié)運(yùn)動后可注射水凝膠與關(guān)節(jié)軟骨表面之間的界面現(xiàn)象

（3）可注射水凝膠的體外生物學(xué)評價(jià)

在評估水凝膠的生物相容性后，研究了其細(xì)胞層面的生物功能。結(jié)果顯示，該凝膠能有效保護(hù)細(xì)胞免受鐵離子損傷（圖3a,b）。通過線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn)，鐵過載會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（紅/綠熒光標(biāo)記，圖3c），而PLED水凝膠能顯著改善膜電位并減少凋亡（圖3d）。流式細(xì)胞術(shù)顯示PLED組凋亡率從9.14%降至5.67%（圖3e,f）。普魯士藍(lán)染色證實(shí)PLED可減少細(xì)胞內(nèi)鐵沉積（圖3g），熒光探針檢測和流式分析（圖3h,i）進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗鐵過載損傷的保護(hù)作用。

圖3 PLED水凝膠體外除鐵行為。（a）染色結(jié)果顯示鐵刺激后在水凝膠保護(hù)下的活細(xì)胞和死細(xì)胞；（b）鐵超載條件下水凝膠對細(xì)胞存活率的影響；（c）鐵超載后線粒體膜電位的變化；（d）CMXRos的熒光強(qiáng)度；（e，f）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；（g）細(xì)胞內(nèi)鐵染色結(jié)果；（h，i）細(xì)胞內(nèi)鐵染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

鐵過載會引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS過量（圖4a,b）。DCFH-DA檢測顯示，PLED水凝膠能顯著降低Fe2?刺激導(dǎo)致的ROS升高（≈10%），使其恢復(fù)至正常水平（圖4c）。MDA（圖4d）、SOD（圖4e）、GSH Px（圖4f）、CAT（圖4g）和總谷胱甘肽（圖4h）等指標(biāo)證實(shí)，PLED較PLD能更有效緩解鐵過載引起的氧化應(yīng)激，使多項(xiàng)指標(biāo)接近正常細(xì)胞水平。通過qRT-PCR評估水凝膠對炎癥誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退化的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，F(xiàn)e2?組COL II基因表達(dá)顯著降低（圖4i），而PLD和PLED水凝膠均能提升COL II表達(dá)，保護(hù)軟骨細(xì)胞。同時(shí)，PLED組能更有效下調(diào)促炎因子（MMP13、IL-1β、IL-6、TNF-α）表達(dá)（圖4j-m），其中對TNF-α的抑制作用尤為顯著。鐵死亡相關(guān)基因檢測表明，F(xiàn)e2?組GPX4（圖4n）、COX2（圖4o）和iNOS（圖4p）表達(dá)升高，PLED和PLD水凝膠均可緩解這一現(xiàn)象。該多功能水凝膠通過EGCG和LA直接清除自由基，DFO螯合鐵離子抑制氧化反應(yīng)；同時(shí)EGCG和LA減少炎癥因子釋放，DFO通過降低鐵離子濃度減輕炎癥反應(yīng)，在細(xì)胞水平展現(xiàn)出優(yōu)異的鐵清除、抗氧化和抗炎效果，具有治療HA的潛力。

圖4 水凝膠的抗炎和抗氧化特性。（a）細(xì)胞內(nèi)ROS熒光染色；（b，c）定量評估細(xì)胞內(nèi)ROS水平；（d）測量細(xì)胞過氧化產(chǎn)物；（e，f，g）細(xì)胞抗氧化酶測定；（h）測量細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平；（i，j）檢測與軟骨退化相關(guān)的基因；（k，l，m）測量鐵刺激細(xì)胞中的炎癥水平；（n，o，p）確定與細(xì)胞內(nèi)鐵死亡相關(guān)的基因

（4）可注射水凝膠的體內(nèi)治療

在完成體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，研究建立了血友病關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)行體內(nèi)評估（圖5a）。首先考察了水凝膠的生物相容性和降解行為（圖5b），結(jié)果顯示水凝膠可持續(xù)存在1個(gè)月且無明顯不良反應(yīng)，有利于長期關(guān)節(jié)炎治療。HA模型小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)水凝膠熒光也證實(shí)了這一特性（圖5c,d）。治療一周后，未治療組膝關(guān)節(jié)明顯腫脹（圖5e,g）伴局部溫度升高（圖5f,h），而PLD和PLED治療組腫脹減輕、溫度恢復(fù)正常。步態(tài)分析顯示（圖5i），未治療組左后肢運(yùn)動明顯受損，PLED組恢復(fù)效果最佳。通過對站立相、擺動相等參數(shù)分析（圖5j）證實(shí)，PLED治療可使部分指標(biāo)恢復(fù)正常水平。

圖5 PLED水凝膠治療HA大鼠。（a）注射水凝膠治療HA實(shí)驗(yàn)方案示意圖；（b）注射PLED水凝膠的皮下降解；（c，d）評估注射水凝膠在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滯留情況；（e）HA模型小鼠關(guān)節(jié)腫脹的代表性圖像；（f）HA模型小鼠關(guān)節(jié)發(fā)熱的紅外圖像；（g）HA模型小鼠關(guān)節(jié)腫脹和（h）發(fā)熱的定量統(tǒng)計(jì)；（i）HA模型小鼠注射水凝膠治療后的步態(tài)分析；（j）HA模型小鼠步態(tài)相關(guān)指標(biāo)的定量分析

通過Micro-CT評估治療后的關(guān)節(jié)周圍骨變化，結(jié)果顯示PLD和PLED凝膠顯著改善了骨贅形成、軟骨下硬化和骨質(zhì)流失。組織學(xué)染色（圖6a）表明，治療組有效緩解了鐵過載導(dǎo)致的滑膜增生和軟骨基質(zhì)降解。普魯士藍(lán)染色顯示治療組幾乎無鐵沉積。免疫熒光分析（圖6a,b-i）證實(shí)，PLED較PLD能更有效促進(jìn)COL II表達(dá)（圖6b），減少膠原流失。同時(shí)顯著調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)蛋白（COX2、GPX4、MMP13、iNOS）（圖6c-f）和促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）（圖6g-i）的表達(dá)。值得注意的是，PLED組的治療效果顯著優(yōu)于PLD組，表明單一鐵清除療法效果有限。EGCG和DFO在鐵螯合方面具有協(xié)同作用，而LA通過抗氧化劑再生增強(qiáng)整體抗氧化能力，三者聯(lián)合提供了更全面持久的治療效果。

圖6 注射水凝膠治療HA后關(guān)節(jié)的組織學(xué)評價(jià)。（a）膝關(guān)節(jié)組織微觀變化（HE、SAF-O、PB）及相關(guān)指標(biāo)免疫熒光染色（COL II、COX2、GPX4、MMP13、iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α）結(jié)果（黑色箭頭代表鐵過載陽性表達(dá)，白色虛線代表關(guān)節(jié)界面）；（b–i）使用ImageJ對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行定量分析的結(jié)果

通過RNA測序分析進(jìn)一步闡明水凝膠治療HA的機(jī)制。PCA分析顯示PLED組可部分逆轉(zhuǎn)鐵過載引起的轉(zhuǎn)錄組變化（圖7a）。差異基因分析發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，PLED組存在2274個(gè)差異表達(dá)基因（圖7b），其中60.7%的上調(diào)基因和39.3%的下調(diào)基因被PLED逆轉(zhuǎn)（圖7c）。關(guān)鍵HA相關(guān)基因分析表明，PLED對Mmp12等分解代謝基因和炎癥基因的調(diào)控作用尤為顯著（圖7d,e）。GSEA分析顯示，鈣信號通路和蛋白質(zhì)消化吸收是富集最顯著的KEGG通路（圖7f,g）。GO分析表明，細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控、陽離子通道活性等是最重要的差異mRNA功能類別。PLED可能通過調(diào)控鈣信號通路、肥大性心肌病等通路發(fā)揮治療作用，并可調(diào)節(jié)Mmp12、IL1rn等基因表達(dá)，這些基因有望成為HA早期診斷或療效監(jiān)測的生物標(biāo)志物。

圖7 PLED水凝膠治療HA模型小鼠后RNA-seq分析。（a）RNA主成分分析（PCA）；（b）生理鹽水組與PLED組差異基因火山圖；（c）生理鹽水組與PLED組差異表達(dá)基因聚類分析；（d，e）生理鹽水組與PLED組HA相關(guān)差異基因分析；（f）HA相關(guān)基因KEGG通路富集分析；（g）HA相關(guān)基因GO富集分析