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針對(duì)上述問(wèn)題，武漢大學(xué)生物工程學(xué)院的李景峰團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種可響應(yīng)糖尿病微環(huán)境的HPA智能水凝膠：將降糖藥二甲雙胍（Met）直接分散于透明質(zhì)酸-苯硼酸/聚乙烯醇網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)早期快速釋放；把成骨肽PTHrP-1錨定于聚多巴胺包覆的ZIF-8納米載體（P1@PZIF-8），實(shí)現(xiàn)后續(xù)持續(xù)釋放。Met先清除ROS、恢復(fù)自噬、抑制細(xì)胞衰老；PTHrP-1與Zn²⁺協(xié)同促進(jìn)Wnt/β-catenin成骨信號(hào)和血管生成。轉(zhuǎn)錄組證實(shí)該體系通過(guò)PI3K-AKT-mTOR通路逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老，在糖尿病大鼠顱骨缺損模型中實(shí)現(xiàn)高效骨再生，為“重編程”氧化應(yīng)激微環(huán)境提供了可臨床轉(zhuǎn)化的自主型組織工程新策略。該文章于2025年10月28日以《Versatile smart hydrogels for spatiotemporal drug delivery to orchestrate diabetic bone regeneration》為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2025.09.049）。

研究示意圖

(1) PZIF-8的制備與表征

PZIF-8由ZIF-8與多巴胺60 °C競(jìng)爭(zhēng)配位-聚合制得，呈平均直徑200 nm、殼厚16.8 nm的中空結(jié)構(gòu)（圖1A-B）；EDS確認(rèn)含C、Zn、N、O，無(wú)外來(lái)毒性元素（圖1C）。PDA外殼使PZIF-8在pH 7.4、37 °C下7天仍保持Tyndall效應(yīng)及緩慢Zn2?釋放，而ZIF-8迅速降解（圖1D）。DLS結(jié)果顯示，PZIF-8的水合半徑為250 nm，并且在不同溶液中該半徑保持相對(duì)不變（圖1E）。FTIR出現(xiàn)PDA特征峰1725、1494、1260 cm^-1，XRD晶體峰消失，XPS Zn2?–N配位減弱并出現(xiàn)新峰，證實(shí)ZIF-8解構(gòu)并被PDA包覆（圖1F–I）。N?吸附呈介孔回線，主孔徑5.5 nm。PTHrP-1經(jīng)物理浸漬載入，包封率85.4%，高于ZIF-8的63.2%（圖1K）；FTIR證明藥物位于空腔而非表面（圖1J）。P1@PZIF-8含C 69.5%、N 14.77%、O 3.36%、Zn 14.41%（圖1L）。

圖1. (A) P1@PZIF-8的示意圖；(B) ZIF-8和PZIF-8的TEM圖像；(C) PZIF-8的SEM-EDX元素映射；(D) ZIF-8和PZIF-8在0天和7天時(shí)在去離子水中觀察到的丁達(dá)爾效應(yīng)；(E) PZIF-8在生理溶液（水、PBS和DMEM）中的粒徑分布；(F) ZIF-8和PZIF-8的FTIR光譜；(G) ZIF-8和PZIF-8的XRD光譜；(H) ZIF-8的XPS光譜；(I) PZIF-8的XPS光譜；(J) P1、PZIF-8和P1@PZIF-8的FTIR光譜；(K) ZIF-8和PZIF-8對(duì)PTHrP-1的包封效率；(L) P1@PZIF-8的EDS分析；(M) ZIF-8、PZIF-8和P1@PZIF-8的zeta電位

（2）水凝膠的制備與表征

通過(guò)形成硼酸酯鍵并與Zn2?離子交聯(lián)，構(gòu)建了一個(gè)由PVA和HPA水凝膠組成的復(fù)合水凝膠（圖2A）。如圖2B所示，PBA的1H NMR譜圖顯示了在7到8 ppm之間的特征芳香質(zhì)子信號(hào)，分配給苯環(huán)上的氫原子（δ = 7.58，m，4H，A），以及在δ = 1.89 ppm處的一個(gè)單峰信號(hào)（3H，B），對(duì)應(yīng)于甲基基團(tuán)。HPA水凝膠由HA-PBA與PVA通過(guò)苯硼酸酯鍵交聯(lián)并引入Zn2?構(gòu)建，室溫凝膠時(shí)間48±2.5 s，摻PZIF-8后縮短至35.3±2.1 s（圖2C）。1H NMR和FTIR在7–8 ppm及1340 cm?1處檢出PBA特征信號(hào)，確認(rèn)接枝成功（圖2B）。SEM顯示五組水凝膠平均孔徑≈85 μm，PZIF-8均勻嵌于孔壁并引入皺紋，EDX映射證實(shí)C、N、O、Zn均勻分布（圖2D–F）。振蕩頻率掃描中復(fù)合水凝膠G′較HPA提高約10倍，拉伸強(qiáng)度33.8±1.6 kPa、為HPA的1.35倍；循環(huán)壓縮5次無(wú)滯后（圖2G–I）。應(yīng)變192%時(shí)G′/G″相交，250%破壞后0.5%應(yīng)變下模量瞬時(shí)可逆恢復(fù)；切斷拼接后自愈樣條模量41.7±4.6 kPa，遠(yuǎn)高于破損樣11.1±2.7 kPa（圖2K）。體外降解：P-HPA 7天剩余77.2%，HPA僅63.5%；28天PBS失重73.1%，25 mM葡萄糖+1 mM H?O?失重90.7%（圖2L）；皮下植入2周保留62.5%。雙藥釋放：Met 12天累計(jì)釋放82.3%，28天87.9%；PTHrP-1持續(xù)釋放，28天達(dá)88.2%（圖2M–N）。

圖2. (A) HPA水凝膠交聯(lián)的示意圖；(B) HA、PBA和HA–PBA的1H NMR譜圖；(C) PVA溶液、HA–PBA溶液和PZIF-8，在混合后迅速形成水凝膠；(D) HPA、P-HPA、P-Met-HPA、PP-HPA和Met-PP-HPA復(fù)合水凝膠的SEM圖像；(E) 孔徑分布的統(tǒng)計(jì)分析；(F) Met-PP-HPA水凝膠的SEM-EDX元素映射；(G) 振蕩頻率掃描，顯示HPA和復(fù)合HPA水凝膠的存儲(chǔ)模量和損失模量與頻率的關(guān)系；(H) 壓縮應(yīng)力–應(yīng)變曲線；(I) 不同水凝膠在恒定應(yīng)變速率下的拉伸應(yīng)力–應(yīng)變曲線；(J) Zn2?增強(qiáng)的HPA雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠示意圖；(K) 原始和自愈合二元復(fù)合水凝膠的拉伸應(yīng)力–應(yīng)變曲線；(L) 復(fù)合水凝膠在28天內(nèi)經(jīng)過(guò)不同處理后的殘留重量比；(M) 復(fù)合水凝膠在28天內(nèi)在不同條件下的Met累積釋放；(N) 復(fù)合水凝膠在不同處理后的PTHrP-1累積釋放

（3）體外釋放與顱骨缺損留存

為了研究PTHrP-1從HPA水凝膠中的釋放行為，Cy5.5標(biāo)記的PTHrP-1被包裹在PZIF-8中并融入水凝膠中。通過(guò)體外和體內(nèi)熒光成像監(jiān)測(cè)釋放過(guò)程。結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫和葡萄糖共同存在時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，PTHrP-1（1 wt%）負(fù)載的水凝膠對(duì)病理微環(huán)境的熒光反應(yīng)最強(qiáng)（圖3B）。在PBS中的PTHrP-1累積釋放結(jié)果與IVIS結(jié)果一致（圖3C），表明HPA水凝膠具有智能響應(yīng)糖尿病微環(huán)境的能力，適合按需藥物遞送。此外，在大鼠顱骨缺損模型中，評(píng)估了Cy5.5標(biāo)記的PTHrP-1在HPA水凝膠中的體內(nèi)熒光保持情況。PP-HPA水凝膠組的信號(hào)衰減明顯慢于PTHrP-1/HPA水凝膠組，后者信號(hào)在第12天后無(wú)法檢測(cè)到（圖3D和3E）。這些結(jié)果表明，PZIF-8錨定的PTHrP-1結(jié)合HPA水凝膠后，可以在骨缺損部位實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定的藥物保持，具有長(zhǎng)期治療應(yīng)用的潛力。

圖3. (A) 評(píng)估在不同條件下（PBS、H?O?（1 mM）、葡萄糖（25 mM）以及H?O?（1 mM）與葡萄糖（25 mM）組合）的HPA水凝膠中PTHrP-1的釋放曲線，利用IVIS成像進(jìn)行詳細(xì)分析；(B) 通過(guò)將水凝膠浸泡在不同溶液中，測(cè)定PTHrP-1的累積釋放曲線；(C) 根據(jù)不同溶液浸泡情況計(jì)算的PTHrP-1的總釋放曲線；(D) 小鼠隨時(shí)間變化的代表性IVIS圖像，展示了PTHrP-1直接融合到HPA水凝膠中，以及PZIF-8錨定的PTHrP-1在植入大鼠顱骨缺損后的整合情況；(E) 使用IVIS成像測(cè)量的植入大鼠顱骨缺損后的樣本的輻射效率和輻射保持比率

（4）高糖微環(huán)境中復(fù)合水凝膠的抗氧化性能

高葡萄糖（HG）使ROS水平升至（圖4A），正常葡萄糖下ROS保持低值（圖4B）。P-Met-HPA、PP-HPA、Met-PP-HPA依次降低ROS，Met-PP-HPA降幅最大；流式細(xì)胞術(shù)顯示該組ROS標(biāo)記BMSCs峰位左移（圖4C）。qRT-PCR示HG抑制抗氧化基因，Met-PP-HPA將其上調(diào)至最高（圖4D）。JC-1染色表明Met-PP-HPA使線粒體膜電位恢復(fù)至近正常水平（圖4E、F），ATP產(chǎn)量同步回升（圖4G）；SOD活性與MDA水平亦被逆轉(zhuǎn)（圖4H、I）。MitoSox Red證實(shí)Met-PP-HPA清除線粒體ROS（圖4J、K）。γH2A.X信號(hào)在Met-PP-HPA組顯著減弱，提示DNA損傷減輕（圖4L、M）。該水凝膠通過(guò)速釋Met及持續(xù)釋放PTHrP-1與Zn2?，抑制ROS、修復(fù)線粒體形態(tài)與功能，促進(jìn)BMSC在高糖環(huán)境存活、成骨并延緩衰老（圖4O）。

圖4. (A) 使用DCFH-DA染色熒光圖像測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS水平；(B) 熒光強(qiáng)度的定量評(píng)估；(C) 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（FCM）使用DCFH-DA作為指示劑評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS水平；(D) BMSCs中抗氧化基因表達(dá)的qRT-PCR定量分析；(E) 使用JC-1熒光染色評(píng)估BMSCs的線粒體膜電位；(F) JC-1聚合物和JC-1單體之間的熒光比率的定量測(cè)量；(G, H, I) 不同處理下BMSCs中的ATP、SOD和MDA水平；(J) 代表性熒光圖像及MitoSOX染色線粒體ROS的定量分析，(K) 對(duì)應(yīng)的MitoSOX染色定量分析；(L) γH2A.X的代表性熒光顯微鏡圖像，(M) γH2A.X免疫熒光的定量分析；(N) 使用水凝膠處理的BMSCs中LC3B、p21和γH2A.X蛋白表達(dá)水平；(O) 描述BMSCs內(nèi)ROS調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制的示意圖

（5）水凝膠可緩解高糖微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞衰老并增強(qiáng)其成骨能力

在高葡萄糖條件下，復(fù)合水凝膠通過(guò)Met和PTHrP-1的協(xié)同作用，抑制了氧化應(yīng)激（OS）加速干細(xì)胞衰老的效應(yīng)（圖5A、B）。Met-PP-HPA組顯示出最強(qiáng)的抗衰老效果，降低了衰老相關(guān)基因和SASP標(biāo)志物的表達(dá)（圖5C、D、E）。Zn²⁺增強(qiáng)了BMSCs的粘附和增殖，PTHrP-1和Met促進(jìn)了BMSCs的遷移。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，Met-PP-HPA組顯著提高了BMSCs遷移能力（圖5F、G）。此外，Met-PP-HPA組也顯著提高了堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅S（ARS）染色的強(qiáng)度，表現(xiàn)出最強(qiáng)的成骨效果（圖5H、I）。免疫熒光染色和RT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)，Met-PP-HPA水凝膠顯著上調(diào)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)（圖5J、K、L）。Met的快速釋放調(diào)節(jié)了ROS水平，延緩了BMSCs衰老，而PTHrP-1的持續(xù)釋放促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖和分化。Zn²⁺則通過(guò)促進(jìn)膠原合成和礦物沉積，進(jìn)一步支持了成骨過(guò)程。

圖5. (A) 水凝膠程序化藥物釋放示意圖，用于調(diào)節(jié)衰老BMSCs并促進(jìn)其成骨分化；(B) 水凝膠處理3天后BMSCs中SASP因子的qRT-PCR分析；(C) BMSCs的SA-β-gal染色；(D) 水凝膠處理3天后BMSCs中p21和p53表達(dá)的qRT-PCR分析；(E) p21的代表性免疫熒光圖像；(F) 水凝膠處理3天后BMSCs的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)；(G) 遷移的定量分析；(H) 第7天的ALP染色；(I) 第21天的ARS染色；(J, L) BMSCs中Col-1和RUNX-2的免疫熒光染色；(K, M) Col-1和RUNX-2熒光強(qiáng)度的定量分析；(N) BMSCs中ALP、RUNX-2和OCN mRNA表達(dá)的qRT-PCR分析

（6）復(fù)合水凝膠治療效果的RNA測(cè)序分析

PCA 將 Met-PP-HPA 組與 HG 組分離（圖 6A）；DESeq2 篩得 2093 個(gè)上調(diào)基因與1019 個(gè)下調(diào)基因（圖 6C）。GO 注釋富集于 DNA 轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激應(yīng)答及 Wnt 信號(hào)；KEGG 指向 SASP、Wnt 與 AGE–RAGE 通路（圖 6E）。GSEA 顯示 PI3K–Akt、TCA 循環(huán)與 DNA 復(fù)制基因集同步變化（圖 6F）。Western blot 定量表明 Met-PP-HPA 提升 p-PI3K、p-AKT、p-mTOR（圖 6G）；LY294002 逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)并升高 p16、p21（圖 6H、I）。Wnt3a、β-catenin、RUNX-2 與 Col-1 同步上調(diào)，XAV939 阻斷后成骨蛋白回落（圖 6J、K）。藥物控釋維持自噬流量（圖 4N），經(jīng) PI3K–AKT–mTOR 軸削減 ROS、延緩衰老，并經(jīng) Wnt/β-catenin 軸驅(qū)動(dòng)成骨分化（圖 6L）。

圖6. (A) 來(lái)自HG組和復(fù)合水凝膠組樣品的PCA分析；(B) 差異基因表達(dá)分析及樣本間相關(guān)性評(píng)估；(D, E) 代表性的和弦圖，展示HG組和Met-PP-HPA水凝膠組之間顯著差異表達(dá)基因（DEGs）相關(guān)的KEGG通路；(F) 基因集富集分析（GSEA）圖，顯示三羧酸（TCA）循環(huán)、細(xì)胞周期和DNA復(fù)制通路的富集情況；(G) 進(jìn)行Western blot分析，評(píng)估PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路以及衰老相關(guān)蛋白（如p16和p21）的表達(dá)；(H, I) p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p16和p21的表達(dá)比值定量比較；(J) Western blot分析Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路及與成骨相關(guān)的蛋白（如RUNX-2和Col-1）；(K) Wnt3a、β-連環(huán)蛋白、RUNX-2和Col-1的表達(dá)定量分析；(L) 復(fù)合水凝膠激活的信號(hào)通路示意圖

（7）復(fù)合水凝膠可減輕高糖微環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的衰老并促進(jìn)其血管生成

為評(píng)估復(fù)合水凝膠的抗衰老和促血管生成作用，我們分析了高葡萄糖條件下HUVECs的衰老情況。結(jié)果顯示，Met-PP-HPA水凝膠顯著降低了衰老相關(guān)基因（p16、p53）的表達(dá)（圖7A和B），SA-β-gal染色也確認(rèn)了Met-PP-HPA組衰老活性的顯著減少（圖7C）。免疫熒光分析表明，Met-PP-HPA組p21表達(dá)減少（圖7D和E），進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗衰老效果。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示Met-PP-HPA水凝膠顯著提高了HUVEC的遷移能力，遠(yuǎn)高于其他組（圖7F）。Matrigel管道形成實(shí)驗(yàn)表明，Met-PP-HPA組形成了最多且連續(xù)的血管網(wǎng)絡(luò)（圖7H和I）。Met-PP-HPA組中HUVEC的血管生成基因（CD31、HIF-1α、VEGF）表達(dá)顯著上升，分別比HPA組高3.7倍、3.4倍和3.9倍（圖7J）。免疫熒光和Western blot進(jìn)一步確認(rèn)了這些結(jié)果，顯示Met-PP-HPA組中CD31、VEGF和HIF-1α蛋白顯著升高（圖7K、L、M和N）。這些結(jié)果表明，Met-PP-HPA水凝膠在高葡萄糖條件下有效緩解細(xì)胞衰老，并顯著促進(jìn)血管生成。

圖7. (A) 水凝膠介導(dǎo)的程序性藥物釋放示意圖，用于調(diào)節(jié)衰老的HUVECs并促進(jìn)血管生成；(B) 采用qRT-PCR分析水凝膠處理3天后HUVECs中SASP因子的表達(dá)；(C) HUVECs的SA-β-gal染色；(D) p21表達(dá)的代表性免疫熒光圖像，(E) 相應(yīng)的熒光強(qiáng)度定量分析；(F) 第3天HUVECs的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，(G) 遷移細(xì)胞的定量分析；(H) HUVECs的管腔形成實(shí)驗(yàn)，(I) 水凝膠處理后形成的管腔數(shù)量定量；(J) 水凝膠培養(yǎng)的HUVECs中血管生成相關(guān)基因（CD31、VEGF、HIF-1α）表達(dá)的qRT-PCR分析；(K) CD31和VEGF的免疫熒光染色，(L) 其熒光強(qiáng)度的定量分析；(M) 水凝膠培養(yǎng)的HUVECs中CD31、VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)的Western blot分析，(N) 相應(yīng)的定量結(jié)果

（8）復(fù)合水凝膠促進(jìn)糖尿病性骨缺損的體內(nèi)再生修復(fù)

STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠顱骨5mm缺損后植入水凝膠（圖 8A），血糖監(jiān)測(cè) 5–7 d 確認(rèn)模型；P-Met-HPA 與 Met-PP-HPA 組血糖略低于其余組。8周微 CT 示 HPA 組僅邊緣少量成骨，Met-PP-HPA 組缺損區(qū)被連續(xù)骨橋封閉（圖 8B）；定量指標(biāo) BV、BV/TV、Tb.N、BMD 均最高（圖 8C）。HE 與 Masson 三色顯示 Met-PP-HPA 組 4 周、8 周新生骨層厚且結(jié)構(gòu)完整，其余組以纖維組織為主（圖 8D、E）。全程心、肝、腎、脾未見(jiàn)病理改變或炎癥，證實(shí)該水凝膠通過(guò)時(shí)空釋藥（Met+PTHrP-1+Zn2?）在糖尿病微環(huán)境中安全促成骨。

圖8. (A) 建模和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序示意圖；(B) 不同水凝膠治療的大鼠顱骨缺損部位的代表性3D重建MicroCT圖像；(C) 對(duì)MicroCT結(jié)果進(jìn)行定量分析，涵蓋參數(shù)如BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD；(D, E) 4周和8周后缺損部位新生骨組織的H&E和Masson三色染色。（FT：纖維組織，NB：新形成的骨組織）

（9）復(fù)合水凝膠促進(jìn)糖尿病性骨缺損的體內(nèi)再生修復(fù)

DHE 熒光強(qiáng)度在 Met-PP-HPA 組降至 29.37 %±10.95 %，對(duì)照組維持 83.13 %±9.40 %（圖 9A、B）。8 周缺損區(qū)免疫熒光顯示，p16?/LepR? 衰老 BMSC 比例在 Met-PP-HPA 組為 6.21 %±1.82 %，HPA 組 35.56 %±1.37 %（圖 9C、D）。RUNX-2 與 Col-1 免疫組化信號(hào)在同一區(qū)域最高（圖 9E、F）。TRAP 陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)于 Met-PP-HPA 組最少（圖 9G、H），CD34?/CD31? 新生血管網(wǎng)密度則最高（圖 9I、J）。時(shí)空釋出的 Met、Zn2? 與 PTHrP-1 通過(guò)清除 ROS、抑制破骨、恢復(fù)自噬、延緩 HUVEC 衰老及促血管-成骨耦合，將糖尿病骨缺損微環(huán)境轉(zhuǎn)為再生狀態(tài)（圖 9K）。

圖9. (A) 使用DHE染色法定量骨組織內(nèi)局部ROS水平的熒光圖像，比例尺：200 μm；(B) DHE熒光強(qiáng)度的定量分析；(C) 顯示糖尿病條件下骨缺損區(qū)域LepR?細(xì)胞中p16表達(dá)的免疫熒光圖像，綠色熒光表示p16陽(yáng)性（p16?）細(xì)胞，紅色熒光表示LepR陽(yáng)性（LepR?）細(xì)胞， (D) LepR?細(xì)胞中p16表達(dá)的熒光強(qiáng)度定量分析；(E) 使用免疫組化染色法檢測(cè)缺損區(qū)域Col-1和RUNX-2的表達(dá)；(F) Col-1和RUNX-2的陽(yáng)性區(qū)域定量分析；(G) 在8周時(shí)對(duì)缺損部位進(jìn)行TRAP染色；(H) TRAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的定量分析。(I) 使用免疫熒光染色法分析缺損區(qū)域CD31和CD34的表達(dá)；(J) CD31和CD34熒光強(qiáng)度的定量分析；(K) 示意圖展示Met-PP-HPA水凝膠在促進(jìn)糖尿病骨再生中的作用。