亚洲强入中文字幕乱码_国产剧爱丫爱丫免费观看_成人激情视频网_4480yy私人影院亚洲_有码+日韩+在线观看_美女任你摸在线视频网站_中文字幕日韩精品内射_亚洲sss777无码整片在线播放_中文字幕2019永久免费视频_男生插曲女生app下载迷你世界

針對上述問題，中國海洋大學(xué)韓璐教授團(tuán)隊(duì)提出了一種“生物-電”協(xié)同治療平臺，該平臺將多酚工程化海帶外泌體（CA@Exos）產(chǎn)生的生物信號與導(dǎo)電微針（pCNTs-ASA MNs）傳遞的電信號相結(jié)合，通過雙通路重塑糖尿病創(chuàng)面愈合過程中的神經(jīng)血管微環(huán)境。CA@Exos作為生物活性載體，可抑制AGEs形成、清除ROS并逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境；同時，其在調(diào)控血管生成和神經(jīng)營養(yǎng)信號方面的固有生物活性，還能增強(qiáng)施萬細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的通訊。與此同時，導(dǎo)電pCNTs-ASA MNs發(fā)揮時空生物電支架的作用：通過傳遞外源性電刺激，既提高了外泌體的細(xì)胞攝取效率，又放大了創(chuàng)面內(nèi)源性電流。這種雙模態(tài)策略協(xié)同促進(jìn)血管生成、神經(jīng)再生及再上皮化，成功實(shí)現(xiàn)了糖尿病大鼠全層創(chuàng)面的閉合。該文章于2025年8月26日以《Conductive Microneedles Loaded With Polyphenol-Engineered Exosomes Reshape Diabetic Neurovascular Niches for Chronic Wound Healing》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202507974）。

圖1. 海帶來源外泌體功能化導(dǎo)電微針通過調(diào)控高糖微環(huán)境與神經(jīng)血管重塑加速糖尿病創(chuàng)面愈合的示意圖。a）制備流程示意圖，包括海帶Exos的分離、外泌體負(fù)載CA得到CA@Exos、ASA與pCNTs復(fù)合導(dǎo)電微針（MNs）的制備，以及將CA@Exos物理吸附于pCNTs-ASA MNs表面，最終得到CA@Exos-MNs貼片的過程。b）CA@Exos-MNs貼片聯(lián)合外源性電刺激的作用機(jī)制：抑制AGEs、ROS生成及炎癥反應(yīng)，同時促進(jìn)細(xì)胞遷移與神經(jīng)血管通訊、膠原沉積，進(jìn)而加速糖尿病創(chuàng)面愈合

（1）海帶來源Exos的分離及其在調(diào)控血管生成和神經(jīng)營養(yǎng)信號中的生物活性

差速離心-超速離心-密度梯度超速離心三步法分離純化海帶來源外泌體，產(chǎn)物富集于蔗糖梯度30%/45%界面（圖2b）。TEM顯示典型杯狀囊泡（圖2c），NTA粒徑3.01×1013 particles/mL（圖2d）。三批次miRNA譜高度重合（圖2e），靶基因GO富集于皮膚發(fā)育、創(chuàng)面愈合、神經(jīng)元分化、軸突導(dǎo)向、免疫、血管生成、細(xì)胞遷移（圖2f）；KEGG前20條通路顯著富集Wnt、軸突導(dǎo)向、神經(jīng)營養(yǎng)因子及NF-κB信號（圖2g）。

HUVEC與施萬細(xì)胞模型驗(yàn)證：10–75 μg/mL外泌體作用24 h細(xì)胞存活率>90%（圖2h,i）；50 μg/mL DiO-外泌體6 h即核周聚集（圖2j,k）。成管實(shí)驗(yàn)50 μg/mL組6 h管長、連接點(diǎn)、覆蓋面積均增（圖2l），VEGF mRNA上調(diào)（圖2m）。施萬細(xì)胞6 d后S100β熒光增強(qiáng)（圖2n），BDNF、NGF、S100β mRNA及BDNF蛋白升高（圖2o）。

綜上所述，這些研究結(jié)果表明，海帶來源外泌體兼具促血管生成與促神經(jīng)生成活性，可用于糖尿病創(chuàng)面神經(jīng)-血管協(xié)同修復(fù)。

圖2. 海帶來源Exos的分離與表征。a）從海帶中分離純化外泌體的流程示意圖。b）純化后外泌體條帶的照片。c）外泌體的TEM圖像。d）通過NTA測得的外泌體粒徑分布與濃度。e）三個不同批次海帶外泌體中前20種miRNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量及其占所有miRNA的比例。f）外泌體miRNA靶基因的GO富集分析柱狀圖，涉及生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別。g）外泌體miRNA靶基因的京都基因與KEGG通路富集散點(diǎn)圖。h、i）HUVECs和施萬細(xì)胞與不同濃度外泌體共培養(yǎng)24小時后的細(xì)胞活力檢測結(jié)果。j、k）HUVECs和施萬細(xì)胞與50 μg/mL DiO標(biāo)記外泌體在完全DMEM培養(yǎng)基中孵育6小時后的熒光成像圖。l）基質(zhì)膠管形成實(shí)驗(yàn)熒光圖：HUVECs分別在完全DMEM培養(yǎng)基（空白組）和含50 μg/mL 外泌體的完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時。m）HUVECs與50 μg/mL外泌體共培養(yǎng)6天后，VEGF基因表達(dá)水平的RT-qPCR檢測結(jié)果。n）施萬細(xì)胞與50 μg/mL外泌體共培養(yǎng)6天后，S100β的免疫熒光染色圖。o）施萬細(xì)胞與50 μg/mL外泌體共培養(yǎng)6天后，BDNF、S100β 和NGF基因表達(dá)水平的RT-qPCR檢測結(jié)果

（2）CA@Exos的制備及其在對抗AGEs積累與氧化還原失衡中的作用

37 ℃共孵2 h將CA載入海帶來源外泌體（圖3a）；CA@Exos zeta電位由?15.35 ± 1.44 mV增至?16.82 ± 0.61 mV（圖3b）。pH 7.4 PBS中72 h累積釋放81.06%，含0.1% Triton X-100組達(dá)96.09% ± 3.14%（圖3c）。葡萄糖-BSA 37 ℃孵育3月得AGE-BSA，溶液色深，SDS-PAGE條帶分子量升高（圖3e、f）。370 nm激發(fā)熒光監(jiān)測顯示，14 d內(nèi)CA@Exos組相對熒光強(qiáng)度顯著低于空白組，Exos組保持≥94%（圖3g）；CA@Exos與預(yù)制AGE-BSA共孵3 d后278 nm紫外吸收峰增強(qiáng)，Exos組無變化（圖3h）。分子對接CA-AGEs結(jié)合能?4.52 kcal/mol，與LYS413、ARG409、SER488形成氫鍵（圖3i）。50 μg/mL CA@Exos與AGE-BSA共作用6 h，施萬細(xì)胞DCFH-DA熒光強(qiáng)度下降（圖3j、k）；50 μM H?O?模型中CA@Exos同樣降低胞內(nèi)ROS（圖3l、m）。DiO-Exos攝取基線實(shí)驗(yàn)顯示，AGE-BSA刺激使胞外熒光升至96586 ± 14270 a.u.，CA@Exos組回降至23293 ± 304 a.u.，接近未處理組23931 ± 669 a.u.（圖3n、o）。CA@Exos通過抑制AGEs生成、結(jié)合預(yù)制AGEs并阻斷RAGE軸，減輕氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞外泌體無效釋放（圖3p）。

圖3. CA@Exos的表征、抗糖基化及抗氧化能力評價(jià)。a）CA@Exos的制備流程示意圖。b）Exos與CA@Exos的zeta電位值。c）CA@Exos在37℃、pH 7.4且含0.5%吐溫80的PBS中72小時的CA釋放曲線。d）AGE-BSA的合成流程示意圖。e）AGE-BSA溶液與BSA溶液在37℃避光條件下孵育3個月后的顏色照片。f）AGE-BSA與BSA的SDS-PAGE圖譜。g）BSA與葡萄糖混合溶液分別加入PBS、Exos或CA@Exos后，在6天、9天、14天時的相對熒光強(qiáng)度。h）CA@Exos溶液、AGE-BSA溶液，以及AGE-BSA與50 μg/mL Exos或CA@Exos共培養(yǎng)3天后的UV-vis吸收光譜。i）分子對接得到的CA與AGEs復(fù)合物最低能量構(gòu)象。j）AGE-BSA存在條件下，CA@Exos作用于施萬細(xì)胞的ROS染色代表性圖像。l）H2O2存在條件下，CA@Exos作用于施萬細(xì)胞的ROS染色代表性圖像。m）定量分析不同處理?xiàng)l件下施萬細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。n）DiO標(biāo)記外泌體循環(huán)利用評價(jià)實(shí)驗(yàn)流程示意圖。o）培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度檢測結(jié)果。p）CA@Exos釋放CA后抑制AGEs形成、緩解氧化應(yīng)激及阻止氧化誘導(dǎo)外泌體分泌的機(jī)制示意圖

（3）多酚工程化外泌體（CA@Exos）在體外促進(jìn)巨噬細(xì)胞重編程、成纖維細(xì)胞遷移及神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建

LPS刺激24 h誘導(dǎo)RAW264.7向M1極化后，繼續(xù)以50 μg/mL CA@Exos處理24 h；iNOS熒光減弱、CD206熒光增強(qiáng)（圖4a），M1/M2比值降至0.45%±0.24%，低于LPS組2.92%±0.75%（圖4b）。L929劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，CA@Exos組24 h遷移率29.09%±4.95%，48 h達(dá)38.88%±1.03%，均高于空白組（圖4c、d）。間接共培養(yǎng)體系中，CA@Exos誘導(dǎo)的施萬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（Schwann cells^CM）使HUVECs血管樣結(jié)構(gòu)增多，CD31、VEGF mRNA上調(diào)（圖4f、g）；反之，CA@Exos處理的HUVECs條件培養(yǎng)基（HUVECs^CM）亦提高施萬細(xì)胞BDNF、S100β、NGF表達(dá)（圖4h）。CA@Exos重塑的分泌微環(huán)境驅(qū)動施萬細(xì)胞與HUVECs雙向交叉調(diào)控，加速神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建。

圖4. CA@Exos在抗炎、促進(jìn)細(xì)胞遷移及神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)中的作用。a）RAW264.7細(xì)胞與 CA@Exos共培養(yǎng)24小時后，CD68與CD86或CD206的免疫熒光共染色圖像。b）M1型與M2型巨噬細(xì)胞比例的定量分析結(jié)果。c）L929細(xì)胞在24小時和48小時的劃痕實(shí)驗(yàn)代表性圖像。d）24小時和48小時細(xì)胞遷移率的定量分析結(jié)果。e）間接共培養(yǎng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)示意圖（用于研究神經(jīng)血管交聯(lián)）：左圖為Schwann cells^CM對HUVECs血管生成的影響，右圖為HUVECs^CM對施萬細(xì)胞神經(jīng)生成的影響。f）基質(zhì)膠管形成實(shí)驗(yàn)熒光圖：HUVECs分別在空白組和施萬細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時。g）HUVECs與施萬細(xì)胞條件培養(yǎng)基孵育24小時后，CD31和VEGF基因表達(dá)水平的RT-qPCR檢測結(jié)果。h）施萬細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基孵育24小時后，BDNF、S100β和NGF基因表達(dá)水平的RT-qPCR檢測結(jié)果

（4）負(fù)載多酚工程化外泌體（CA@Exos）的導(dǎo)電微針制備與表征

pCNTs與ASA的DMSO混合液注入PDMS模具，離心后60 ℃干燥8 h，制得8×8 mm2、100針陣列（圖5a、b）。0–10 wt.% pCNTs梯度微針壓縮測試顯示，pCNTs 5 wt.%時機(jī)械強(qiáng)度最高，達(dá)3.73±0.33 N/針（圖5c、d）；四探針法測得同比例薄膜電導(dǎo)率0.049±0.004 S/cm，CV氧化還原電流高于純ASA（圖5e、f）。DPPH清除率隨pCNTs增加而升高，5 wt.%組為70.66%±5.07%，與10 wt.%組（73.47%）無顯著差異（圖5g）。

以5 wt.% pCNTs-ASA微針物理吸附CA@Exos得CA@Exos-MNs，針尖表面粗糙度增加（圖5i），DiO熒光3D重建顯示CA@Exos均勻分布于針尖（圖5j）。施萬細(xì)胞表面貼附CA@Exos-MNs 1.5 h后施加400 mV、0.5 h電刺激，胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度較無電刺激組提高1.53倍（圖5k、l）。豬皮穿刺20 min，CLSM觀測微通道及DiO信號深達(dá)480 μm（圖5m）；BALB/c小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用DiD-CA@Exos-MNs，6 h可檢出熒光并持續(xù)至48 h（圖5n）。

5 wt.% pCNTs-ASA導(dǎo)電微針兼具3.73 N/針機(jī)械強(qiáng)度、0.049 S/cm電導(dǎo)率及70%自由基清除能力，可負(fù)載CA@Exos并在電刺激下實(shí)現(xiàn)透皮480 μm深度遞送與細(xì)胞內(nèi)化，體內(nèi)滯留≥48 h，為糖尿病創(chuàng)面治療提供遞送平臺。

圖5. CA@Exos-MNs的制備與表征。a）pCNTs-ASA 微針的制備流程示意圖。b）pCNTs-ASA微針的宏觀圖像。c）不同pCNTs含量的pCNTs-ASA微針的壓縮力 - 位移曲線。d）pCNTs-ASA微針的壓縮力（N/針）。e）不同pCNTs含量的pCNTs-ASA微針的電導(dǎo)率。f）不同pCNTs含量的pCNTs-ASA微針的循環(huán)伏安（CV）曲線。g）不同pCNTs含量的pCNTs-ASA微針的DPPH自由基清除率。h）通過將CA@Exos物理吸附于pCNTs-ASA微針表面制備CA@Exos-MNs的流程示意圖。i）CA@Exos-MNs的SEM圖像。j）DiO標(biāo)記CA@Exos-MNs的代表性CLSM 3D重建圖像。k）施萬細(xì)胞在DiO標(biāo)記CA@Exos-MNs下方培養(yǎng)，施加400 mV、30分鐘電刺激（ES）的實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。l）有無電刺激條件下，施萬細(xì)胞對CA@Exos的攝取率。m）DiO標(biāo)記CA@Exos從微針中釋放并穿透豬皮不同深度的CLSM圖像。n）小鼠背部創(chuàng)面應(yīng)用DiD標(biāo)記CA@Exos-MNs后，不同時間點(diǎn)（6、24、48小時）的在體熒光成像圖

（5）CA@Exos-MNs聯(lián)合ES在糖尿病創(chuàng)面愈合中的體內(nèi)療效

第2天創(chuàng)面免疫熒光：CA@Exos-MNs+ES組CD206?面積升高、CD86?面積降低，M2極化優(yōu)于CA@Exos-MNs組（圖7a）。第14天AGEs熒光：CA@Exos-MNs與CA@Exos-MNs+ES組信號顯著低于其余各組（圖7b）。第28天CD31/α-SMA共定位：CA@Exos-MNs+ES組新生血管數(shù)量與成熟度最高（圖7c）。NF200與PGP9.5熒光顯示，CA@Exos-MNs+ES組神經(jīng)密度顯著增加（圖7c）。CK14表達(dá)在同一組達(dá)峰值，再上皮化程度最大（圖7d）。

CA@Exos-MNs聯(lián)合電刺激通過抑制AGEs、促進(jìn)M2極化、加速血管-神經(jīng)協(xié)同重建并增強(qiáng)表皮分化，實(shí)現(xiàn)糖尿病創(chuàng)面最快完全愈合。

圖6. CA@Exos-MNs聯(lián)合ES在糖尿病創(chuàng)面愈合中的體內(nèi)治療效果。a）SD大鼠糖尿病全層皮膚創(chuàng)面的治療方案示意圖。b）CA@Exos-MNs聯(lián)合電刺激治療SD大鼠的實(shí)物照片。c）不同治療組從0天到28天的創(chuàng)面照片。d）不同治療組從0天到28天的創(chuàng)面閉合軌跡圖。e）28天創(chuàng)面愈合率的定量分析結(jié)果。f）28天不同治療組創(chuàng)面組織切片的H&E染色代表性圖像。g）28天創(chuàng)面皮膚表皮厚度的定量分析結(jié)果

圖7. CA@Exos-MNs聯(lián)合ES在糖尿病創(chuàng)面愈合中對炎癥的調(diào)控、糖基化的抑制及神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)重建的促進(jìn)作用。a）不同治療組2天創(chuàng)面組織切片的免疫熒光染色圖。b）不同治療組14天創(chuàng)面組織切片的AGEs免疫熒光染色圖。c）不同治療組28天創(chuàng)面組織切片的CD31與αSMA共染、NF200、PGP 9.5和CK14免疫熒光染色。d）免疫熒光染色圖像中 CD86、CD206、AGEs、CD31、αSMA、NF200、PGP 9.5、CK14陽性區(qū)域的定量分析結(jié)果

（6）CA@Exos-MNs聯(lián)合ES促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

抗氧化基因熱圖：Sod2、Hmox1、Itgb2、Itgam、Acod1、Nnt、H19顯著上調(diào)（圖8e-g）。血管生成基因Vcam1、C3、Ptgs2、Chi3l1、Fgf1（圖8h-j）與神經(jīng)生成基因Cfl2、Camk2a、Camk2b、Disc1、Dcx、Dpysl5同步升高（圖8k-m）。Chi3l1、Plcβ-Ca2?-CaMKII軸激活ERK1/2與cGMP-PKG級聯(lián)，Camk2a/b協(xié)同驅(qū)動血管與神經(jīng)生成。CA@Exos-MNs+ES通過Hmox1/Sod2緩解氧化應(yīng)激，并經(jīng)ERK1/2-cGMP-PKG網(wǎng)絡(luò)加速神經(jīng)血管重建，最終促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合（圖8n）。

圖8. 糖尿病創(chuàng)面組織的RNA測序分析。a）空白組與CA@Exos-MNs+電刺激治療組的基因數(shù)量對比韋恩圖。b）空白組與CA@Exos-MNs+電刺激治療組之間差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖。c）CA@Exos-MNs+電刺激治療組差異表達(dá)基因的GO分類圖。d）已鑒定差異表達(dá)基因的KEGG富集通路分析圖。e-h）CA@Exos-MNs+電刺激治療組與空白組相比，抗氧化相關(guān)基因（e）、血管生成相關(guān)基因（h）的顯著上調(diào)熱圖，以及Sod2（f）、Hmox1（g）、Plcβ2（i）、Chi3l1（j）的每千堿基百萬片段（FPKM）值。k-m）CA@Exos-MNs+電刺激治療組與空白組相比，神經(jīng)再生相關(guān)基因的顯著上調(diào)熱圖（k），以及Camk2a（l）、Camk2b（m）的FPKM 值。n）CA@Exos-MNs 聯(lián)合電刺激促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的潛在機(jī)制示意圖