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針對(duì)上述問(wèn)題，溫州醫(yī)科大學(xué)羅麗華、王周光、徐俊鵬和蔡曉軍團(tuán)隊(duì)提出了一種創(chuàng)新的無(wú)細(xì)胞治療策略：他們將人脫落乳牙干細(xì)胞（SHEDs）裂解物（CL） 封裝于纖維蛋白原/凝血酶（FT）水凝膠中，構(gòu)建出具有抗炎與促血管生成雙重功能的FT/CL智能水凝膠系統(tǒng)。該文章于2025年07月28日以《A cell-free SHED lysate-hydrogel system for oral ulcer healing with anti-inflammatory and pro-angiogenic effects》為題發(fā)表于《Journal of Nanobiotechnology》（DOI: 10.1186/s12951-025-03597-3）。

圖1 研究示意圖

（1）SHEDs和CL的成功培養(yǎng)與表征

成功從人脫落乳牙牙髓中分離出SHEDs，細(xì)胞表現(xiàn)出典型的MSC特性：免疫熒光染色CD146和Stro-1呈陽(yáng)性；圖2A-C: 顯示原代SHEDs生長(zhǎng)良好，表達(dá)MSC標(biāo)志物（CD146/Stro-1），并具有成骨、成脂、成軟骨分化能力。具備成骨、成脂、成軟骨的多向分化潛能；通過(guò)反復(fù)凍融法成功制備SHEDs來(lái)源的CL；考馬斯亮藍(lán)染色證實(shí)CL的蛋白質(zhì)譜與原始SHEDs高度相似。圖2D: 考馬斯亮藍(lán)染色證明CL的蛋白成分與原始SHEDs相似。CCK-8和活/死細(xì)胞染色表明CL無(wú)細(xì)胞毒性，且最佳濃度（150 μg/mL）能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的增殖。圖2E-G: CCK-8和活/死染色表明CL無(wú)細(xì)胞毒性，且150 μg/mL濃度能最佳促進(jìn)HUVECs增殖。

圖2 SHED和CL的培養(yǎng)和表征。A SHED的原代培養(yǎng)。B MSC標(biāo)記CD146和Stro-1的免疫熒光染色。C SHED的成骨、成脂和軟骨發(fā)育分化。D相同數(shù)量細(xì)胞的SHED和CL考馬斯藍(lán)染色。E不同CL劑量下HUVECs細(xì)胞增殖情況F鈣黃素-AM（綠色）和PI（紅色）染色不同CL濃度下HUVECs G各組平均活細(xì)胞數(shù)F在所有實(shí)驗(yàn)中，n=3個(gè)生物重復(fù)的數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001

（2）FT/CL水凝膠的優(yōu)化與性能表征

SEM圖像顯示圖3A:水凝膠具有均勻多孔結(jié)構(gòu)。圖3B-C: 降解和釋放曲線表明FT (1:1.5) 水凝膠能持續(xù)降解并控制CL釋放超過(guò)60小時(shí)。圖3D-F: 活/死染色和CCK-8證明水凝膠生物相容性好，且FT (1:1.5) 促進(jìn)細(xì)胞增殖效果最佳。通過(guò)篩選不同纖維蛋白原與凝血酶比例，確定FT (1:1.5) 為最佳配方，兼具良好的凝膠時(shí)間、降解速率和生物相容性。該水凝膠具備：均勻的多孔三維結(jié)構(gòu)。圖3G-H: 水凝膠表現(xiàn)出良好的可注射性，且FITC標(biāo)記顯示其能在口腔潰瘍面穩(wěn)定粘附超過(guò)24小時(shí)?？煽氐腃L釋放能力（36小時(shí)釋放超過(guò)60%），展示出優(yōu)異的可注射性和強(qiáng)大的組織粘附性。

圖3 FT水凝膠的表征。A FT水凝膠的SEM圖像。B FT水凝膠在PBS中孵育的降解曲線。C 不同比例水凝膠中CL的累積釋放。D 與FT水凝膠共培養(yǎng)的HUVECs的鈣黃綠素-AM/PI染色圖像和(E)通過(guò)Image J的定量。F 與FT水凝膠共培養(yǎng)的HUVECs的OD值。G FT水凝膠的可注射性和宏觀凝膠化。H 通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光染料評(píng)估異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的FT水凝膠的滯留性。在所有實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均以 n = 3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD表示：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（3）FT/CL水凝膠在體外展現(xiàn)出抗炎與促血管生成雙重功效

抗炎作用：在與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)T/CL水凝膠能：在LPS誘導(dǎo)的M1模型中，顯著抑制促炎因子iNOS和TNF-α的表達(dá)。圖4A-H: 免疫熒光染色及定量顯示，F(xiàn)T/CL能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的M1標(biāo)志物（iNOS, TNF-α），并促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的M2標(biāo)志物（CD206, Arg1）表達(dá)。在IL-4誘導(dǎo)的M2模型中，顯著促進(jìn)抗炎因子CD206和Arg1的表達(dá)。圖4I-K: 血管形成實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)T/CL處理組的管狀網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜，管腔長(zhǎng)度和數(shù)量顯著高于對(duì)照組。促血管生成作用：在血管形成實(shí)驗(yàn)中，與FT/CL水凝膠共培養(yǎng)的HUVECs：形成的管腔長(zhǎng)度是對(duì)照組的2.5倍。形成的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量是對(duì)照組的3.7倍。

圖4 FT/CL水凝膠在體外抑制炎癥并促進(jìn)血管生成。A iNOS, B TNF-α, C CD206 和 D Arg1（紅色）以及CD68（綠色，巨噬細(xì)胞標(biāo)志）在不同組中的免疫熒光染色。各組E iNOS, F TNF-α, G CD206 和 H  Arg1 表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析。I 8小時(shí)后HUVECs的血管形成圖像。J 描繪管長(zhǎng)度的半定量分析。K 描繪管數(shù)量的半定量分析。在所有實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均以 n = 3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（4）FT/CL水凝膠在大鼠口腔潰瘍模型中加速愈合

宏觀愈合：FT/CL治療組潰瘍面積縮小最快，在第3、5、7天均保持最小。圖5B: 系列舌部照片顯示FT/CL組潰瘍愈合最快，第5天上皮幾乎完全恢復(fù)。行為學(xué)改善：顯著減少由疼痛引起的面部擦拭和口腔摩擦行為。圖5C-F: 行為學(xué)分析表明FT/CL組能顯著減少疼痛引起的面部擦拭和口腔摩擦次數(shù)。 促進(jìn)體重恢復(fù)，表明全身狀況改善。臨床評(píng)分：宏觀評(píng)分顯示FT/CL組臨床嚴(yán)重程度最低，無(wú)出血或膿腫。圖5G-H: FT/CL組體重恢復(fù)最快，宏觀臨床評(píng)分最低。

圖5 FT/CL水凝膠治療組在傷口愈合和酸誘發(fā)口腔潰瘍（OU）的行為評(píng)估方面顯示出更好的改善。A 顯示傷口產(chǎn)生和隨后的愈合階段的說(shuō)明圖。B 7 天內(nèi)舌頭的代表性圖像。白線表示舌頭上的特定傷口。C 說(shuō)明圖和第 1、2、3 天 3 分鐘時(shí)間內(nèi)擦拭面部的次數(shù)。 D Ctrl 組和 FT/CL 組之間的比較。E 說(shuō)明圖以及第 1、2 和 3 天 3 分鐘塊期間的口腔摩擦次數(shù) (F)。*，Ctrl 組和 FT/CL 組之間的比較。G 與酸刺激后第 0 天相比體重的變化。H 宏觀評(píng)分評(píng)估 OU 的臨床嚴(yán)重程度。在所有實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均以 n = 3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（5）FT/CL水凝膠促進(jìn)高質(zhì)量的組織重塑

組織學(xué)顯示：治療第7天，F(xiàn)T/CL組表現(xiàn)出：最完整的再上皮化，上皮層更厚、結(jié)構(gòu)更成熟。圖6A-B: HE染色顯示FT/CL組上皮最完整、血管最豐富（黑色箭頭）。豐富的再生血管和成熟有序的膠原纖維沉積。圖6C-D: Masson染色顯示FT/CL組膠原排列有序且沉積量合理。細(xì)胞水平驗(yàn)證：Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，表明細(xì)胞增殖活躍。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，表明細(xì)胞凋亡被有效抑制。 圖6E-H: Ki67和TUNEL染色表明FT/CL組細(xì)胞增殖最活躍，凋亡最少。

圖6 FT/CL水凝膠在第7天修復(fù)OU大鼠舌組織的有效性。A 潰瘍舌組織的HE染色。黑色箭頭表示再生血管。B 潰瘍舌組織的Masson染色。C 基底膜下血管的定量。D 膠原合成的定量分析。E 酸誘導(dǎo)潰瘍組織中 Ki67 的代表性免疫熒光圖像。F 各組Ki67表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。G 潰瘍舌組織的 Tunel 染色。H 各組tunel陽(yáng)性細(xì)胞的定量分析。在所有實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均以 n = 3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（6）FT/CL水凝膠在體內(nèi)強(qiáng)力促進(jìn)血管再生

治療第7天，通過(guò)多種技術(shù)驗(yàn)證其促血管生成能力：圖7A-D: 免疫熒光顯示FT/CL組CD31和VEGF表達(dá)強(qiáng)度最高，表明新生血管密度最高。qPCR與WB：CD31和VEGF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)。圖7E-F: qPCR證實(shí)FT/CL組CD31和VEGF的mRNA水平最高。圖7G-I: Western Blot進(jìn)一步在蛋白水平驗(yàn)證了CD31和VEGF的上調(diào)。

圖7 FT/CL治療組在第7天顯示出更好的血管再生促進(jìn)作用。A 酸誘導(dǎo)潰瘍組織中CD31的代表性免疫熒光圖像和(B) VEGF的代表性免疫熒光圖像。C 各組CD31表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析和(D) VEGF表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。E 各組CD31的mRNA表達(dá)水平和(F) VEGF的mRNA表達(dá)水平。G 免疫印跡（WB）檢測(cè)各組CD31和VEGF蛋白表達(dá)水平。H CD31 和 (I) VEGF 的平均蛋白表達(dá)水平。在所有實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均以 n = 3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

（7）FT/CL水凝膠在體內(nèi)有效調(diào)控炎癥反應(yīng)

治療第3天（炎癥高峰期）的組織分析顯示：HE染色：FT/CL組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最少，基底膜再生最早。圖8A: 第3天HE染色顯示FT/CL組炎癥浸潤(rùn)最輕，組織架構(gòu)恢復(fù)最好。圖8B: 免疫熒光顯示FT/CL組iNOS/TNF-α信號(hào)最弱，而CD206/Arg1信號(hào)最強(qiáng)。免疫熒光與WB：促炎M1標(biāo)志物（iNOS, TNF-α）表達(dá)最低，而抗炎M2標(biāo)志物（CD206, Arg1）表達(dá)最高，證明其能有效將巨噬細(xì)胞從M1表型極化為M2表型，從而控制炎癥。圖8C-H: Western Blot定量證實(shí)FT/CL組顯著抑制了M1蛋白表達(dá)，促進(jìn)了M2蛋白表達(dá)。

圖8 FT/CL治療組在第3天表現(xiàn)出更好的炎癥調(diào)節(jié)。A 潰瘍舌組織的HE染色。B 酸誘導(dǎo)潰瘍組織中 iNOS、TNF-α、CD206 和 Arg1 的代表性免疫熒光圖像。C M1 標(biāo)記物 iNOS 和 TNF-α 的蛋白質(zhì)印跡分析。D M2 標(biāo)記 CD206 和 Arg1 的蛋白質(zhì)印跡分析。E iNOS 和 (F) TNF-α 的蛋白表達(dá)水平。G CD206 和 (H) Arg1 的蛋白表達(dá)水平。在所有實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)均以 n = 3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD 表示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001