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針對上述問題，溫州醫(yī)科大學(xué)肖健團隊開發(fā)一種可注射鐵響應(yīng)水凝膠TC@BS（單寧酸-殼聚糖負(fù)載BSA@Se），利用單寧酸螯合ex-iron降鐵負(fù)荷，同時釋放BSA@Se清除ROS，抑制鐵死亡、恢復(fù)線粒體形態(tài)與功能；該體系可在DFU創(chuàng)面提供機械支撐并促進血管新生，從而加速糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，并揭示其通過調(diào)控鐵死亡代謝通路增強內(nèi)皮細(xì)胞活性的機制。該文章于2025年8月22日以《A multifunctional hydrogel promotes diabetic wound healing by remodeling iron balance and energy metabolism》為題發(fā)表于《Biomaterials》（DOI：10.1016/j.biomaterials.2025.123640)。

圖1.高糖狀態(tài)下TC@BS在內(nèi)皮細(xì)胞鐵代謝平衡和線粒體TCA循環(huán)中的作用示意圖

（1）糖尿病創(chuàng)面鐵過載和鐵死亡水平升高

鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡形式，與多種病理狀況相關(guān)。在糖尿病傷口愈合中，單細(xì)胞組學(xué)分析顯示，來自愈合和未愈合糖尿病足潰瘍的細(xì)胞被聚類成七個不同細(xì)胞群體（Fig. 2A）。內(nèi)皮細(xì)胞在兩組間表現(xiàn)出顯著差異。GO富集分析揭示脂肪酸代謝、脂肪酸運輸和脂質(zhì)運輸?shù)汝P(guān)鍵生物過程在兩組間顯著改變（Fig. 2B）。擬時序分析表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育軌跡與GPX4和VEGF的下調(diào)以及IL-6的上調(diào)相關(guān)（Fig. 2C和D）。細(xì)胞進展與鐵死亡、血管生成和炎癥有更強關(guān)聯(lián)（Fig. 2E）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，在DM組中，F(xiàn)TH1和GPX4的表達顯著低于對照組，而TFR1表達較高（Fig. 2F和G）。免疫組織化學(xué)染色顯示，DM組傷口組織中GPX4和FTH1的陽性點顯著較少（Fig. 2J–L和K-M）。免疫熒光染色顯示，4-HNE的熒光強度在DM組較高（Fig. 2H和I）。普魯士藍(lán)染色表明，DM組傷口組織中的鐵濃度顯著增加（Fig. 2N和O-Q）。人樣本的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果同樣顯示，DM患者傷口組織中FTH1和GPX4表達較低，而TFR1表達較高（Fig. 2R）。

圖2 鐵離子誘導(dǎo)糖尿病創(chuàng)面鐵死亡的驗證。（a）非糖尿病與糖尿病患者足部皮膚單細(xì)胞tSNE聚類圖，細(xì)胞按類型著色；（b）內(nèi)皮細(xì)胞GO富集分析；（c）內(nèi)皮細(xì)胞偽時序發(fā)育軌跡；（d）隨擬時序GPX4、VEGF下降而IL-6上升；（e）兩組創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞GPX4、FTH1、SLC7A11、IL6、VEGFA表達對比；（f–g）小鼠正常與糖尿病創(chuàng)面FTH1、TFR1、GPX4的WB結(jié)果；（h–i）小鼠創(chuàng)面4-HNE免疫熒光代表性圖像及定量；（j–k）小鼠創(chuàng)面GPX4免疫組化代表性圖像及定量；（l–m）小鼠創(chuàng)面FTH1免疫組化代表性圖像及定量；（n–o）小鼠正常與糖尿病創(chuàng)面普魯士藍(lán)染色代表性圖像及鐵沉積定量；（p–q）患者正常與糖尿病創(chuàng)面普魯士藍(lán)染色代表性圖像及鐵沉積定量；（r）患者創(chuàng)面FTH1、TFR1、GPX4的WB結(jié)果。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（2）高糖和Fe3?誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡和能量代謝障礙

在HG和Fe3?處理組中，ROS和脂質(zhì)過氧化水平顯著高于對照組（Fig. 3A, I, sFig. 1A, B）。細(xì)胞內(nèi)Fe2?濃度在HG和Fe3?刺激下顯著升高（Fig. 3B, J）。線粒體膜電位下降，表現(xiàn)為紅熒光減少和綠熒光增加（Fig. 3C, K）。線粒體融合減少或分裂增加（Fig. 3E-F, L），且線粒體超微結(jié)構(gòu)顯示膜破碎、嵴缺失、紊亂和空泡化（Fig. 3D）?？硅F死亡蛋白GPX4表達在HG和Fe3?組下調(diào)（Fig. 3G-H, M）。蛋白質(zhì)印跡分析表明，TFR1表達在Fe3?組顯著高于HG組，DMT1表達在兩組均高于對照組但無顯著差異，而FPN表達在HG和Fe3?組下調(diào)（Fig. 3N）。HUVECs的遷移能力被HG和Fe3?抑制（Fig. 3O, P）。ATP水平下降，MDA水平上升（Fig. 3Q, R）。OCR顯示呼吸能力相關(guān)參數(shù)降低（Fig. 3S）。

圖3 鐵離子誘導(dǎo)HUVEC鐵死亡及能量代謝紊亂的體外驗證。（a）CellROX代表性圖像及定量；（b）FerroOrange代表性圖像及定量；（c）JC-1檢測線粒體膜電位代表性圖像及定量；（d）TEM超微結(jié)構(gòu)；（e-f）MitoTracker線粒體形態(tài)代表性圖像及定量；（g-h）GPX4免疫熒光代表性圖像及定量；（i）鐵代謝相關(guān)蛋白FTH1、TFR1、FPN、DMT1的WB；（j-k）劃痕實驗代表性圖像及遷移率定量；（l-m）ATP與MDA含量；（n）Cell Mito Stress Test檢測OCR曲線。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns無顯著性，n = 3

（3）TC@BS水凝膠的表征

根據(jù)管反轉(zhuǎn)試驗，TA與CC混合物在室溫凝膠化后能穩(wěn)定附著于管底，表明水凝膠形成（Fig. 4A）。SEM顯示TC具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)，適合作為載體（Fig. 4B）。流變學(xué)實驗證實水凝膠具備穩(wěn)定的流變學(xué)性能和可注射性（Fig. 4C–F）。隨著TC水凝膠中TA濃度增加，F(xiàn)eCl3溶液顏色由黃變?yōu)樯罹G，表明Fe3?被還原為Fe2?（Fig. 4G）。鐵離子螯合能力檢測顯示TC對鐵的螯合能力顯著高于CC（Fig. 4H）。EDS分析確認(rèn)BSA@Se納米顆粒中S和Se元素均勻分布（Fig. 4I）。SEM顯示BSA@Se呈圓形，粒徑小于100 nm（Fig. 4J, K）。負(fù)載BSA@Se后TC水凝膠的形態(tài)與孔結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著改變，BSA@Se成功附著于孔隙表面（Fig. 4L）。在PBS環(huán)境中，TC@BS能良好粘附于心臟、肝、脾、肺及腎組織表面（Fig. 4M, sFig. 2A）。溶脹實驗表明TC@BS在FeCl3中的溶脹率顯著高于PBS環(huán)境（Fig. 4N）。釋放實驗顯示TC@BS在FeCl3中的釋放效果更優(yōu)（Fig. 4O）。

圖4 TC@BS的表征。（a）TA、CC與TC倒置實驗；（b）CC與TC表面及截面SEM圖；（c-d）CC與TC孔徑分布；（e）TC水凝膠流變性能；（f）水凝膠可注射演示；（g）TC與不同濃度Fe3?溶液反應(yīng)顏色變化；（h）CC與TC鐵螯合能力；（i）BSA@Se的EDS元素分布；（j）BS的SEM圖；（k）BS粒徑；（l）TC@BS的SEM圖及BS在TC中的分布；（m）TC@BS在PBS中粘附心、肝、脾、腎組織切片；（n）TC@BS在PBS與Fe3?溶液中的溶脹行為；（o）TC@BS在PBS與Fe3?溶液中BS的體外釋放曲線

（4）TC@BS水凝膠的生物安全性和生物相容性

溶血試驗顯示TC、BS和TC@BS的溶血率與PBS組無顯著差異，均低于5%，表明材料具有良好的生物相容性（Fig. 5A, B）。CCK-8和EdU染色實驗證實Fe3?處理引發(fā)細(xì)胞毒性，而TC、BS和TC@BS處理能顯著恢復(fù)細(xì)胞活力（sFig. 3A–C）。Calcein-AM/PI雙染色結(jié)果顯示TC@BS處理有效減少Fe3?誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（Fig. 5C, D）。纖維連接蛋白粘附實驗表明Fe3?處理顯著降低HUVECs粘附能力，TC@BS預(yù)處理可減輕該抑制作用（Fig. 5E, F）。管形成、遷移和劃痕實驗證明Fe3?暴露損害內(nèi)皮細(xì)胞的管形成和遷移功能，TC@BS處理則恢復(fù)這些功能參數(shù)（Fig. 5G–L）。Western blot分析顯示Fe3?處理導(dǎo)致VE-Cadherin、AAMP和VEGF-A表達下調(diào)，而TC@BS后處理能逆轉(zhuǎn)這些分子變化（Fig. 5M, N）。

圖5 TC@BS的生物相容性。（a）溶血率對比（PBS、TC、BS、TC@BS，Triton為陽性對照）；（b）Calcein/PI活死染色圖像及定量；（c）細(xì)胞-基質(zhì)黏附實驗圖像及定量；（d）成管實驗圖像及節(jié)點數(shù)定量；（e）Transwell遷移實驗圖像及計數(shù)；（f）劃痕愈合實驗圖像及遷移率；（g）WB檢測VE-Cadherin、AAMP、VEGF-A表達

（5）TC@BS體外抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡水平

在高糖微環(huán)境中，將HUVECs與水凝膠共培養(yǎng)后進行分析。DCFA-DA染色顯示，TC、DFO和TC@BS組的細(xì)胞ROS水平均顯著低于Fe3?組，其中TC@BS組效果最為顯著（Fig. 6C, H）。FerroOrange染色表明TC@BS組在降低細(xì)胞內(nèi)游離亞鐵離子方面作用最為明顯，其水平接近對照組（Fig. 6D, I）。C11-BODIPY染色顯示TC@BS組脂質(zhì)過氧化顯著降低，而Fe3?組則顯著升高（Fig. 6E-F, J）。FTH1免疫熒光結(jié)果與FerroOrange染色趨勢一致（Fig. 6G, K）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與Fe3?組相比，TC、DFO和TC@BS組的FTH1和FPN表達顯著增強，而TFR1和DMT1表達則顯著降低（Fig. 6L, M）。綜上，靶向水凝膠能減少細(xì)胞外鐵積累，抑制HUVECs鐵死亡，并維持細(xì)胞活性（Fig. 6N）。

圖6 TC@BS體外維持HUVEC鐵代謝平衡。（a）共培養(yǎng)實驗示意圖；（b）分組方案；（c）CellROX熒光圖像及定量；（d）FerroOrange鐵離子熒光圖像及定量；（e-f）C11-BODIPY581/591脂質(zhì)過氧化熒光與2.5D重建圖像及定量；（g）FTH1免疫熒光圖像及定量；（h-k）WB檢測FTH1、TFR1、FPN、DMT1表達；（l）TC@BS在高鐵微環(huán)境中抗鐵死亡機制示意圖。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（6）TC@BS介導(dǎo)的糖尿病創(chuàng)面修復(fù)通過減輕線粒體功能障礙的能量代謝重編程

MitoSox Red檢測顯示Fe3?組線粒體ROS熒光增強，而DFO與TC@BS水凝膠處理后熒光減弱（Fig. 7A, C）。JC-1染色表明Fe3?組線粒體膜電位下降，DFO與TC@BS處理可恢復(fù)膜電位，紅熒光強度顯著增強（Fig. 7D, E）。MitoTracker Red染色與線粒體透射電鏡顯示Fe3?組線粒體過度分裂、腫脹、嵴結(jié)構(gòu)紊亂或消失，而DFO與TC@BS組線粒體分裂減少、嵴結(jié)構(gòu)完整、膜結(jié)構(gòu)未破壞（Fig. 7F–I）。蛋白質(zhì)印跡分析表明DFO與TC@BS處理可升高Opa1、Mfn1及Mfn2表達，降低Drp1表達（Fig. 7K）。實時PCR結(jié)果顯示DFO與TC@BS能夠促進線粒體呼吸鏈復(fù)合體I、IV、V相關(guān)基因表達（Fig. 7J）。OCR檢測表明Fe3?誘導(dǎo)后呼吸能力相關(guān)參數(shù)下降，TC、DFO及TC@BS處理可恢復(fù)這些參數(shù)，其中TC@BS的治療效果強于TC和DFO（Fig. 7L）。TC、DFO及TC@BS處理可提升ATP水平并降低MDA水平，TC@BS的作用效果優(yōu)于TC和DFO（Fig. 7M, N）。結(jié)果表明，TC@BS可恢復(fù)線粒體氧化代謝平衡、形態(tài)與功能，并糾正細(xì)胞能量代謝失衡（Fig. 7O）。

圖7 TC@BS體外修復(fù)HUVEC線粒體功能。（a）實驗分組示意；（b）MitoSOX超氧陰離子熒光圖像及定量；（c-d）JC-1線粒體膜電位圖像與定量；（e-f）MitoTracker線粒體形態(tài)圖像及定量；（g）TEM超微結(jié)構(gòu)；（h）呼吸鏈復(fù)合物基因RT-PCR熱圖；（i）WB檢測Opa1、Drp1、Mfn1、Mfn2；（j）OCR曲線；（k-l）ATP與MDA含量；（m）水凝膠調(diào)控高鐵微環(huán)境代謝重編程機制圖。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（7）TC@BS促進糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合

在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中評估TC/DFO/TC@BS對傷口修復(fù)的影響。宏觀觀察圖像顯示，盡管所有組別的傷口面積均隨時間減小，但TC@BS組在第5、10、15天時的傷口面積均小于TC組和DFO組（Fig. 8B-D）。TC@BS組的愈合效果接近未注射STZ的對照組水平。組織H&E和Masson染色顯示，與第5天未見明顯上皮化的DM組相比，TC/DFO/TC@BS處理的糖尿病傷口形成了結(jié)構(gòu)清晰的新生表皮，其中TC@BS組效果最為顯著。通過H&E結(jié)果計算傷口長度發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第5天和第10天，TC@BS組的傷口長度最短，其次為DFO組、TC組和DM組（Fig. 8E-G）。

圖8 TC@BS促進糖尿病鼠創(chuàng)面愈合。（a）動物實驗流程；（b-c）創(chuàng)面愈合照片及示意圖；（d）五組相對創(chuàng)面面積定量；（e-f）第5、10天H&E與Masson染色及傷口長度統(tǒng)計。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（8）TC@BS促進糖尿病小鼠創(chuàng)面血管生成，減少鐵過載和脂質(zhì)過氧化

激光多普勒血流成像顯示，在術(shù)后第5天和第10天，TC/DFO/TC@BS處理組的傷口邊緣及創(chuàng)面血流灌注量均高于DM組，其中TC@BS組血流灌注量接近對照組水平（Fig. 9A, F）。α-SMA免疫熒光染色表明，TC/DFO/TC@BS組在術(shù)后第5天和第10天的新生血管及成熟血管數(shù)量均多于DM組，以TC@BS組最為顯著（Fig. 9B, G）。免疫組化染色顯示TC/DFO/TC@BS處理可恢復(fù)傷口組織中FTH1的表達（Fig. 9C, H）。普魯士藍(lán)染色表明各處理組降低了體內(nèi)鐵離子含量（Fig. 9D, I）。4-HNE免疫熒光顯示TC/DFO/TC@BS處理顯著降低了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，TC@BS組效果最為明顯（Fig. 9E, J）。傷口組織蛋白的Western blot結(jié)果與上述實驗結(jié)論一致（Fig. 9K, L）。免疫熒光結(jié)果顯示TC@BS可促進巨噬細(xì)胞向M2表型極化（sFig. 4A-F），并減少中性粒細(xì)胞浸潤（sFig. 4G）；ELISA檢測證實TC@BS降低了體內(nèi)炎癥水平（sFig. 4H-J）。透射電鏡分析表明TC@BS處理在體內(nèi)可顯著改善內(nèi)皮細(xì)胞線粒體形態(tài)（sFig. 9A）。血液檢測及主要器官H&E染色證明TC@BS水凝膠無明顯毒性（sFig. 5A-K）。結(jié)果表明，TC@BS水凝膠能顯著促進糖尿病傷口血管生成，降低鐵離子含量、炎癥水平及脂質(zhì)過氧化程度。

圖9 TC@BS重塑內(nèi)皮鐵代謝并降低脂質(zhì)過氧化以促進血管新生。（a）術(shù)后3、7天激光多普勒血流圖；（b）α-SMA免疫熒光及定量；（c）FTH1免疫組化及定量；（d）普魯士藍(lán)鐵染色及定量；（e）4-HNE免疫熒光及定量；（f-g）創(chuàng)面組織FTH1、TFR1、FPN、DMT1的WB分析。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3

（9）TC@BS通過激活PI3K-AKT途徑抑制鐵死亡

對DM組和TC@BS+DM組的傷口組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析?；鹕綀D顯示兩組間存在顯著差異表達基因（Fig. 10A），主成分分析表明樣本具有良好重復(fù)性（sFig. 8A）。KEGG富集和?；鶊D分析顯示，PI3K-AKT信號通路與鐵死亡通路在前10條通路中存在顯著差異，其中鐵死亡在下調(diào)生物過程中被顯著抑制（Fig. 10B, sFig. 8B）。GO富集分析表明兩組在脂質(zhì)代謝、脂肪酸結(jié)合及NADPH氧化酶復(fù)合物等方面存在顯著差異（Fig. 10C）?；蚣患治鼋Y(jié)果與KEGG和GO分析一致（Fig. 10D-F）。兩組間鐵死亡相關(guān)和血管生成相關(guān)mRNA表達結(jié)果與前期實驗結(jié)果相符（Fig. 10G）。結(jié)果表明靶向水凝膠可能通過上調(diào)PI3K-AKT通路抑制鐵死亡，進而促進傷口愈合。

圖10 TC@BS處理的RNA-seq分析。（a）TC@BS+DM vs DM差異基因火山圖（紅/藍(lán)分別示顯著上/下調(diào)）；（b）KEGG富集氣泡圖（大小示基因數(shù)，顏色示p值）；（c）GO富集（藍(lán)、綠、橙分別對應(yīng)生物過程、細(xì)胞組分、分子功能）；（d-f）GSEA鐵死亡、氧化磷酸化、PI3K-AKT通路的NES與p值；（g）FTH1、SLC7A11、GPX4、VEGFA、DRP1表達驗證。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，每組n = 4

（10）NOX4參與DM介導(dǎo)的創(chuàng)傷和Fe3?處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鐵性下垂

對經(jīng)Fe3?處理且有無TC@BS干預(yù)的細(xì)胞蛋白進行WB分析，結(jié)果顯示DFO與TC@BS處理顯著促進PI3K和AKT的磷酸化（Fig. 11A–C）。IHC染色表明在體內(nèi)TC@BS處理組p-PI3K和p-AKT表達高于DM組（Fig. 11D–G, sFig. 10A–D）。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示AKT與NOX4存在強關(guān)聯(lián)（Fig. 11H）。WB與IF結(jié)果顯示TC@BS組顯著降低NOX4表達（Fig. 11I–J, Q），IHC染色同樣表明TC@BS組NOX4表達較低（Fig. 11K, L）。使用PI3K-AKT通路抑制劑LY294002進行預(yù)處理，可顯著抑制PI3K-AKT通路磷酸化并促進NOX4表達（Fig. 11M–P）。結(jié)果表明TC@BS水凝膠通過激活PI3K/AKT通路并抑制NOX4表達，為糖尿病傷口提供了一種調(diào)控鐵代謝和鐵死亡的治療策略（Fig. 11R）。

圖11 TC@BS通過激活PI3K/AKT通路抑制NOX4介導(dǎo)的鐵死亡。（a）PI3K、AKT及p-AKT的WB分析；（b-c）p-PI3K免疫組化圖及定量；（d-e）p-AKT免疫組化圖及定量；（f）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；（g-h）NOX4的WB分析；（i-j）NOX4免疫組化圖及定量；（k）NOX4免疫熒光圖及定量；（l-o）不同處理組p-PI3K、p-AKT與NOX4的WB分析；（p）TC@BS調(diào)控鐵死亡與線粒體的信號通路示意圖。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，n = 3