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針對(duì)上述問(wèn)題，重慶大學(xué)羅忠/胡燕教授團(tuán)隊(duì)提出了一種活體微生態(tài)微針貼片（LMMP），它能夠緩解感染性糖尿病傷口（IDW）部位的缺氧問(wèn)題，同時(shí)減輕過(guò)度炎癥和微生物感染。通過(guò)席夫堿反應(yīng)將改性的羧甲基殼聚糖（CMC）與氧化透明質(zhì)酸（OHA）交聯(lián)，生成柔性片狀水凝膠基質(zhì)；隨后通過(guò)聚合物澆鑄，使小球藻（Chl）整合的微針通過(guò)甲基丙烯酸酐改性透明質(zhì)酸（HAMA）-Chl混合物的光交聯(lián)作用形成在水凝膠貼片上，實(shí)現(xiàn)了小球藻的穩(wěn)定錨定。LMMP能夠無(wú)痛地刺穿表層并穩(wěn)定附著在傷口組織上，通過(guò)基于光合作用的局部氧合作用，同時(shí)抑制慢性炎癥和微生物感染，以微創(chuàng)的方式促進(jìn)傷口的微環(huán)境重塑，從而顯著加速I(mǎi)DW的愈合。該文章于2025年6月3日以《Living Microecological Microneedle Patches Enable Proregenerative Microenvironmental Remodeling for Promoting Infected Diabetic Wound Healing》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.5c05381）。

圖1. LMMP的合成過(guò)程及感染性糖尿病傷口（IDW）治療機(jī)制示意圖

（1）LMMP 的制備與表征

0.1–10 rad/s振蕩流變中，LMMP與無(wú)藻對(duì)照GAMP的儲(chǔ)能模量G′均高于損耗模量G″，表明基底呈凝膠態(tài)，可貼合創(chuàng)面并承受機(jī)械應(yīng)力（圖2C）。GAMP在去離子水及PBS中4 h溶脹率≈200%，含水率≈70%；30 °C開(kāi)放環(huán)境4 h脫水率<30%，LMMP與GAMP無(wú)差異（圖2E、F）。力-位移曲線(xiàn)顯示，單針承受0.34 N（LMMP）/0.32 N（GAMP）時(shí)位移達(dá)60%，未斷裂；按壓即可刺入小鼠皮膚，移除后微孔5 min內(nèi)閉合（圖2G、H）。

在含16.7 mM葡萄糖+200 μM H?O?的模擬IDW液（SITF）中10 h，LMMP的GA釋放量較PBS組高200%，硼酸酯鍵斷裂實(shí)現(xiàn)IDW響應(yīng)性釋放（圖2I）。

（2）LMMP 介導(dǎo)的產(chǎn)氧能力評(píng)估

不同濃度小球藻在光照下的溶氧變化顯示，5×10? 個(gè)/mL 組絕對(duì)氧濃度升至 6.3 mg/L，5×10? 個(gè)/mL 組僅達(dá) 4.2 mg/L，呈濃度依賴(lài)性（圖 2J）。據(jù)此，LMMP 構(gòu)建采用 5×10? 個(gè)/mL 作為前體濃度。L929 與 HUVEC 分別與該濃度藻體共孵育，細(xì)胞活力無(wú)顯著下降，提示藻體生物相容性良好（圖 2K）。等藻量下，LMMP 與游離藻的溶氧曲線(xiàn)重疊，證實(shí)微針包封未削弱光合活性（圖 2L）。仿生緩沖液中連續(xù)監(jiān)測(cè) 7 d，LMMP 釋氧濃度前 4 d 維持≈6 mg/L，第 7 d 降至≈5 mg/L，呈現(xiàn)持續(xù)產(chǎn)氧能力（圖 2M）。IDW 氧水平通常<1 mg/L，而健康組織為 2–8 mg/L；LMMP 光誘導(dǎo)下可持續(xù)輸出 5–6 mg/L 溶解氧，滿(mǎn)足臨床復(fù)氧需求。

圖2. LMMP 的制備與表征。（A）OHA和HAMA的傅里葉變換紅外光譜。（B）CMC-PBA的傅里葉變換紅外光譜。（C）GAMP和LMMP在37°C下的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G''）。（D）LMMP的掃描電子顯微鏡圖像。（E）LMMP在水和PBS中孵育后的溶脹率。（F）GAMP和LMMP在30°C下的脫水率。（G）GAMP和LMMP的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線(xiàn)。（H）LMMP在小鼠皮膚上的處理效果及移除后皮膚恢復(fù)的圖像分析。（I）在模擬IDW條件下LMMP中GA的釋放曲線(xiàn)。（J）氧合測(cè)量過(guò)程的示意圖。（K）不同濃度Chl孵育后L929細(xì)胞的存活率變化。（L）光刺激下LMMP介導(dǎo)的氧氣生成。（M）不同樣品產(chǎn)氧能力的時(shí)間依賴(lài)性變化

（3）LMMPs 的體外抗菌能力評(píng)估

結(jié)晶紫定量表明，LMMP+光照對(duì)已形成生物膜的四菌存活率分別為10%、9%、8%、8%，證實(shí)其破壞生物膜并殺滅駐留菌的能力（圖3H–L）。該復(fù)合微針無(wú)需抗生素即可在體外快速清除IDW相關(guān)病原體。

圖3. LMMPs的體外抗菌能力。（A）經(jīng)MP和LMMP處理4小時(shí)后，大腸桿菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的存活率。（B-E）不同處理后大腸桿菌（B）、銅綠假單胞菌（C）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（D）和白色念珠菌（E）的相對(duì)微生物存活率。（F）經(jīng)LMMP處理后，通過(guò)碘化丙啶（紅色）和SYTO 9（綠色）染色得到的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的共聚焦圖像。（G）不同處理后微生物形態(tài)的掃描電子顯微鏡圖像。（H）不同處理組生物膜的結(jié)晶紫染色圖像。（I-L）生物膜中微生物病原體存活情況的定量分析

（4）LMMP 的體外生物相容性分析

高生物相容性是開(kāi)發(fā)生物組織工程材料的關(guān)鍵要求。該研究通過(guò)多種細(xì)胞模型在體外對(duì)LMMP系統(tǒng)的生物相容性進(jìn)行了全面研究（圖 4A）。首先，將LMMP與L929細(xì)胞和HUVECs共同孵育6小時(shí)，隨后采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。值得注意的是，兩種細(xì)胞經(jīng)處理后的活力均超過(guò)100%（圖 4B、C）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）的活/死染色分析也顯示幾乎無(wú)細(xì)胞死亡，進(jìn)一步證實(shí)了CCK-8測(cè)定的結(jié)果（圖 4E）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)LMMP對(duì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)毒性。同時(shí)，考慮到感染性糖尿病傷口（IDW）常伴隨皮膚潰瘍和出血，我們還通過(guò)將樣品與提取的血細(xì)胞共同孵育，測(cè)試了LMMP的溶血性能。結(jié)果顯示，LMMP組的溶血率僅約為3%，表明其適用于IDW的治療（圖 4D）。

（5）LMMP 的體外微生態(tài)復(fù)氧作用

低氧（1 % O?）環(huán)境下，RDPP 熒光指示 6 h 后 PBS、MP 及 GAMP 組仍呈強(qiáng)信號(hào)，ChlMP 與 LMMP 組熒光完全消失，證實(shí)小球藻光照產(chǎn)氧可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞缺氧（圖 4F、G）。隨后，HUVEC 在 LMMP+光照條件下培養(yǎng) 8 h，管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、分支及總長(zhǎng)度均達(dá)最大值（圖 5A、B）；劃痕與 Transwell 結(jié)果顯示 48 h 遷移面積最小、侵襲細(xì)胞數(shù)最多（圖 5C、E、G）。WB 表明 PI3K-AKT 與 MAPK-ERK 磷酸化水平顯著升高（圖 5I–L）。L929 成纖維細(xì)胞同樣于 LMMP+光照組呈現(xiàn)最快劃痕閉合及最高遷移數(shù)（圖 5D、F、H）。黑暗條件下 LMMP 無(wú)上述效應(yīng)，且相關(guān)信號(hào)通路未被激活。數(shù)據(jù) collectively 說(shuō)明，光照激活 LMMP 產(chǎn)氧，方可觸發(fā)血管內(nèi)皮與成纖維細(xì)胞促再生程序，加速 IDW 樣環(huán)境中的血管形成與組織修復(fù)。

圖4. LMMP的體外生物相容性及促愈合能力評(píng)估。（A）共培養(yǎng)模型示意圖。（B）不同處理后 L929 細(xì)胞的活力。（C）不同處理后HUVECs的活力。（D）不同樣品的溶血活性。（E）LMMP與L929細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞相容性。（F）不同處理下缺氧L929細(xì)胞中的氧豐度。（G）不同處理下缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的氧豐度。（H）不同處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的光學(xué)成像

圖5. LMMP在體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的調(diào)控作用及潛在分子機(jī)制研究。（A、B）不同處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）分支點(diǎn)數(shù)量（A）和管長(zhǎng)（B）的定量分析。（C）不同處理后HUEVC遷移能力的定量分析。（D）不同處理后L929細(xì)胞遷移能力的定量分析。（E）不同處理后HUEVC遷移的光學(xué)圖像。（F）不同處理后L929細(xì)胞遷移的光學(xué)圖像。（G）不同處理后HUEVC的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（H）不同處理后L929細(xì)胞的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（I）不同處理（有光照）后HUEVC中p-PI3K/p-AKT激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（J）不同處理（無(wú)光照）后HUEVC中p-PI3K/p-AKT激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（K）不同處理（有光照）后HUEVC中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（L）不同處理（無(wú)光照）后HUEVC中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（M）不同處理（有光照）后L929細(xì)胞中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（N）不同處理（無(wú)光照）后L929細(xì)胞中p-Erk激活狀態(tài)的免疫印跡分析

（6）LMMP 介導(dǎo)的體外抗炎效果評(píng)估

ELISA 結(jié)果表明，LMMP+光照使 TNF-α 和 IL-1β 分泌量分別下降 70 % 與 75 %，IL-4 和 IL-10 上升 300 % 與 230 %（圖 6F–I）；qPCR 測(cè)得對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子 mRNA 趨勢(shì)一致（圖 6J–M）。數(shù)據(jù) collectively 說(shuō)明，LMMP 通過(guò) GA 按需釋放驅(qū)動(dòng) M1→M2 重編程，降低促炎、升高抗炎因子，實(shí)現(xiàn) IDW 局部炎癥消退。

圖6. LMMP的體外免疫調(diào)節(jié)效果評(píng)估。（A）RAW264.7細(xì)胞中CD206（綠色）和iNOS（紅色）表達(dá)的熒光顯微鏡圖像。（B、C）iNOS（B）和CD206（C）相對(duì)熒光強(qiáng)度的定量分析。（D）不同處理后M1和M2型巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)頻率的流式細(xì)胞術(shù)分析。（E）不同處理后RAW264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1激活狀態(tài)的WB分析。（F-I）RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同處理后，TNF-α（F）、IL-1β（G）、IL-4（H）和IL-10（I）水平的ELISA結(jié)果。（J-M）RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同處理后，TNF-α（J）、IL-1β（K）、IL-4（L）和IL-10（M）mRNA表達(dá)水平的qPCR分析

（7）LMMP 介導(dǎo)的IDW體內(nèi)治療效果評(píng)估

免疫熒光定量：LMMP+光照組K14?基底角質(zhì)形成細(xì)胞形成連續(xù)層，K10?棘層厚度顯著高于Con+（圖8A-C）；CD31熒光強(qiáng)度115.29%，較Con+（86.87%）提升（圖8D、E）。蛋白印跡證實(shí)PI3K-AKT、MAPK-ERK及Nrf2-HO-1三條通路同步激活，VEGFA上調(diào)（圖7D-F）。巨噬細(xì)胞極化：iNOS?細(xì)胞下降90%，CD206?細(xì)胞增加500%，M1/M2比值顯著降低（圖8F-H）。qPCR顯示TNF-α、IL-1β mRNA下調(diào)，IL-4、IL-10 mRNA上調(diào)（圖8I-L）。數(shù)據(jù)collectively表明，LMMP通過(guò)光合復(fù)氧-巨噬細(xì)胞重編程-血管新生級(jí)聯(lián)，克服糖尿病抗愈合應(yīng)激，實(shí)現(xiàn)MRSA-IDW快速修復(fù)。

圖7. LMMP介導(dǎo)的IDW愈合的體內(nèi)分析。（A）在ICR小鼠模型上評(píng)估LMMP效果的實(shí)驗(yàn)設(shè)置示意圖。（B）9天內(nèi)不同處理后的傷口隨時(shí)間變化的閉合情況。（C）在第0、3、5、7和9天不同處理后的傷口愈合進(jìn)程。（D）不同處理后IDW組織中p-PI3K/p-AKT激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（E）不同處理后IDW組織中MAPK-ERK1/2激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（F）不同處理后IDW組織中Nrf2-HO-1激活狀態(tài)的免疫印跡分析。（G）第4天和第9天受傷皮膚的H&E染色和馬松三色染色結(jié)果

圖8.LMMP加速I(mǎi)DW愈合的體內(nèi)機(jī)制研究。（A）不同處理后IDW組織中細(xì)胞角蛋白10（K10，綠色）和細(xì)胞角蛋白14（K14，紅色）的免疫熒光染色結(jié)果。（B）不同處理后IDW組織中CD31的免疫染色結(jié)果。（C）不同處理后IDW組織中iNOS和CD206的免疫熒光染色結(jié)果。（D、E）細(xì)胞角蛋白14（D）和細(xì)胞角蛋白10（E）的定量分析結(jié)果。（F）CD31表達(dá)的定量分析結(jié)果。（G、H）iNOS（G）和CD206（H）表達(dá)的定量分析結(jié)果。（I-L）不同處理后IDW組織中TNF-α（I）、IL-1β（J）、IL-4（K）和IL-10（L）分泌水平的相對(duì)表達(dá)量