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針對上述問題，浙江大學方向前/趙玥綺/唐?？?劉昭明團隊構(gòu)建了一種“時空自適應(yīng)”納米遞送系統(tǒng)，在修復早期把 NAD? 精準送進促炎巨噬細胞，代謝重編程使其轉(zhuǎn)向抗炎修復表型；晚期再將 NAD? 靶向衰老干細胞，恢復其分化潛能。單藥（NAD?）分階段作用于兩種功能障礙細胞，成功逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松小鼠的骨缺損并加速皮膚創(chuàng)面愈合，為代謝-納米-再生一體化治療提供新平臺。該文章于2025年10月1日以《Spatiotemporal-adaptive nanotherapeutics promote post-injury regeneration in ageing through metabolic modulation》為題發(fā)表于《Nature Nanotechnology》（DOI：10.1038/s41565-025-02017-9）。

（1）NAD?作為恢復巨噬細胞與干細胞代謝穩(wěn)態(tài)的潛在靶點

對老齡小鼠皮膚損傷模型在早期（4 dpi）與晚期（7 dpi）的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示，F(xiàn)4/80?巨噬細胞與Prrx1c細胞中NAD?消耗酶（CD38、PARPs）顯著上調(diào)（Fig. 1a–d），提示二者存在共同的NAD?耗竭機制。NAD?作為細胞代謝關(guān)鍵輔酶（Fig. 1e），其下降與干細胞功能衰退及免疫失衡相關(guān)。炎性巨噬細胞中CD38/PARP過度激活導致NAD?合成失衡與SIRT1下調(diào)（Fig. 1f,g）；SIRT1抑制NF-κB介導的炎癥反應(yīng)（Fig. 1h），因此NAD?補充有助于重編程巨噬細胞表型。然而，NAD?膜通透性有限（Fig. 1i），需依賴合理納米載體實現(xiàn)有效遞送。

基于此，構(gòu)建葡萄糖修飾的巨噬細胞/干細胞雜合膜包覆NAD?負載ZIF-8納米顆粒（NZM），實現(xiàn)炎癥期與修復期的時空自適應(yīng)靶向遞送。炎癥期NZM優(yōu)先靶向促炎性巨噬細胞，通過溶酶體逃逸釋放NAD?，誘導代謝重塑與抗炎轉(zhuǎn)化；修復期NZM富集于衰老干細胞，恢復NAD?水平，增強線粒體功能，促進組織再生。該系統(tǒng)同時減弱巨噬細胞與衰老干細胞間的促炎信號互作，并在骨缺損與全層皮膚創(chuàng)傷模型中驗證了修復效果。

圖1.（a）老齡小鼠4 dpi創(chuàng)面UMAP分群及F4/80?巨噬Adgre1表達；（b）巨噬NAD?消耗酶熱圖；（c）7 dpi UMAP分群及Prrx1?干細胞標記；（d）干細胞NAD?消耗酶熱圖；（e）胞內(nèi)NAD?合成-消耗通路；（f）LPS刺激巨噬NAD?代謝基因聚類；（g）LPS組NAD?及NAD?/NADH下降；（h）NAD?補充重塑巨噬表型示意；（i）NAD?需經(jīng)胞外酶降解為NAM/NR再攝取

（2）NZM的構(gòu)建與時空自適應(yīng)靶向驗證

ZIF-8原位礦化負載NAD?（載藥量6.2 ± 0.44 %），粒徑/晶型與空載體一致；FTIR證實羰基存在，XRD證實晶型保留（圖2a、b及圖1a–d）。BMSC與BMDM膜經(jīng)超聲-擠出融合成雜合膜（HM），共定位驗證融合，冷凍電鏡呈囊泡狀，ζ電位–25 mV（圖1e–g）。HM蛋白組GO顯示膜定位富集，含SEC62、Tmed9、Gnai3、Syntaxin-7（圖2c、d）。插入葡萄糖脂質(zhì)得GHM，綠色熒光確認（圖2e及圖1h）。GHM與NZ共擠出得NZM，粒徑增大，ζ電位由正轉(zhuǎn)負；冷凍電鏡示核-殼結(jié)構(gòu)，Western blot驗證膜蛋白保留（圖2f–h及圖1i、j）。PBS中7 d無聚集，pH 5.5下72 h NAD?釋放達80 %（圖2i、j）。炎癥模型（M1:MΦ:MSC:NIH3T3=3:1:4）中，NZM對M1巨噬細胞攝取率分別是MSC與成纖維細胞的4.1倍與3.8倍；修復模型（1:3:4）中，NZM對MSC攝取率提高3.5倍（圖2k–p）。在高成纖維背景正常微環(huán)境中，NZM仍保持M1/MSC選擇性，未修飾顆粒無差異。

圖2.（a）NZM制備示意圖；（b）NZM在早期炎癥期靶向巨噬細胞、晚期修復期靶向干細胞的模式圖；（c）雜合膜蛋白GO細胞組分分類；（d）囊泡靶向與融合相關(guān)蛋白列表；（e）HM/DSPE-PEG2000-FITC熒光共定位及Pearson系數(shù)，標尺10 μm；（f–g）GHM、NZ、NZM的粒徑與ζ電位；（h）NZ及NZM的cryo-TEM圖像，標尺100 nm；（i）NZM與NZ在PBS中的膠體穩(wěn)定性；（j）pH 7.4與5.0下NZM的NAD+釋放曲線；（k）共培養(yǎng)模型模擬炎癥與修復階段的流式評估示意圖；（l–m）炎癥期（M1:MSC:NIH3T3=3:1:4）與修復期（1:3:4）Cy5-NZM細胞攝取流式圖及MFI；（n–p）以原代成纖維細胞替換NIH3T3的炎癥與修復模型中Cy5-NZM攝取MFI，n=4

（3）NZM對炎性巨噬細胞的靶向和調(diào)節(jié)作用

RNA-seq顯示LPS激活的M1巨噬細胞GLUT1（Slc2a1）表達升高（圖3a、b）；GHM包被Cy5-NZM在M1細胞內(nèi)的攝取量高于未修飾NZ或HM-NZM，且該優(yōu)勢被GLUT1抑制劑phloretin取消（圖3c、d）。NZM經(jīng)能量依賴的clathrin介導內(nèi)吞進入溶酶體，酸觸發(fā)降解后時間依賴性釋放NAD?至胞質(zhì)，溶酶體完整性及酸化未受干擾（圖3e、f）。NZM使LPS刺激的巨噬細胞NAD?及NAD?/NADH比值恢復，ATP升高，葡萄糖消耗與乳酸輸出減少，脂質(zhì)累積降低，代謝由糖酵解轉(zhuǎn)向氧化磷酸化（圖3g–k）。表型上，iNOS下調(diào)、ARG1上調(diào)（圖3l），促炎基因Nos2、Cd86降低，抗炎基因Arg1、Cd206升高（圖3m）；IL-1β、IL-6、TNF-α分泌減少，IL-10、TGF-β1、VEGF增加，CD206、CD301表達升高，LPS損傷的吞噬功能恢復（圖3l–m）。

圖3.（a）GLUT1介導NZM攝取示意圖；（b）LPS刺激巨噬葡萄糖轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)錄組聚類；（c）Cy5染料、NZ、無糖基NZM、NZM及NZM+phloretin攝取圖像，標尺50 μm；（d）流式定量Cy5陽性巨噬比例，n=5；（e）4 °C或內(nèi)吞抑制劑預處理后NZM攝取流式定量，n=5；（f）Cy5-NZM與溶酶體共定位及Pearson系數(shù)，1 h與5 h，標尺10 μm，n=5；（g–h）經(jīng)游離NAD?或NPs處理后巨噬胞內(nèi)NAD?及NAD?/NADH比值，n=5；（i）胞內(nèi)ATP水平，n=5；（j）實時葡萄糖與乳酸濃度，n=3；（k）Bodipy-493/503脂滴熒光強度，n=3；（l）iNOS與ARG1免疫熒光，標尺10 μm；（m）RT-PCR檢測Nos2、Cd86、Arg1、Cd206表達，n=4

(4) NZM調(diào)節(jié)巨噬細胞代謝和免疫生態(tài)位

轉(zhuǎn)錄組顯示，29 544個基因中6 276個差異表達；PCA將對照、LPS及LPS+NZM三者清晰分開（圖4a–c）。GO/GSEA表明LPS抑制TCA循環(huán)、氧化磷酸化、脂肪酸及谷氨酰胺代謝并激活NF-κB/TNF信號，NZM則上調(diào)Ndufb10、Cox6b2、Idh2、Acox1等氧化代謝基因，下調(diào)IL-6通路Socs3、Stat3（圖4e、f）。細胞外通量檢測證實NZM恢復線粒體呼吸并抑制糖酵解（圖4g、h）；線粒體膜電位及呼吸鏈復合體活性同步改善。13C-葡萄糖示蹤顯示糖酵解中間產(chǎn)物進入TCA循環(huán)的比例升高，檸檬酸、富馬酸、蘋果酸及衣康酸的碳交換率顯著增加（圖4i）。代謝組學篩選（P < 0.05，VIP > 1）發(fā)現(xiàn)NZM相比LPS組增加16種、減少44種代謝物；KEGG注釋主要涉及有機酸、?；|(zhì)及氨基酸代謝（圖4j）。差異代謝物顯著富集于花生四烯酸代謝，NZM降低血栓烷B?、PGE?、11,12-EET、6-keto-PGF?α、(±)15-HETE及PGJ?等脂質(zhì)炎癥介質(zhì)水平（圖4j）。同時，TCA循環(huán)中琥珀酸累積減少，單酰甘油MG(20:4/0:0/0:0)、MG(0:0/20:4/0:0)及游離脂肪酸FFA(12:0)含量下降，提示脂肪酸降解加速、促炎脂質(zhì)信號受抑（圖4j–l）。機制上，NZM提升NAD?后顯著增強SIRT1活性，抑制p65核轉(zhuǎn)位并提高PGC1β表達（圖4m）。SIRT1通過去乙?；瘻缁頝F-κB p65，減少促炎基因轉(zhuǎn)錄，同時激活PGC1β以增強線粒體氧化代謝。SIRT1抑制劑EX527可逆轉(zhuǎn)NZM誘導的TCA循環(huán)、氧化磷酸化及脂肪酸氧化相關(guān)基因表達上調(diào)，并削弱抗炎效應(yīng)（圖4n）。此外，NZM處理巨噬細胞的條件培養(yǎng)基可抑制破骨細胞分化，挽救LPS受損的成骨潛能，并增強內(nèi)皮細胞血管生成活性，表明其通過重塑分泌譜構(gòu)建促再生微環(huán)境。

圖4.（a）LPS vs LPS+NZM差異基因熱圖，n=3；（b）差異基因Venn圖（|log2FC|≥1，adjP<0.05）；（c）PCA分離兩組轉(zhuǎn)錄譜；（d）GO富集；（e）氧化磷酸化及脂肪酸氧化相關(guān)基因火山圖；（f）GSEA示TCA、OXPHOS、FAO上調(diào)，NF-κB、IL-6、IL-17信號下調(diào)；（g–h）ECAR與OCR應(yīng)激曲線，n=3；（i）U-[13C]葡萄糖示蹤m+3/m+2/m+1比例，n=4；（j）差異代謝物熱圖，n=4；（k）KEGG通路富集；（l）脂質(zhì)代謝火山圖；（m）SIRT1、PGC1β核定位及p65入核定量，標尺10 μm，n=4

(5) NZM促進線粒體，防止MSC衰老

膜修飾NZM在MSC內(nèi)的攝取量高于NZ。H?O?誘導衰老模型中，MSC的NAD?、NAD?/NADH及ATP水平下降，NZM顯著回升且無明顯毒性（圖5a–c）。流式及SA-β-Gal染色顯示NZM減少凋亡與衰老，γH2AX、p16、p21信號降低（圖5d、e）。衰老/炎癥基因Cdkn1a、Il6下調(diào)，周期基因Cdk4、Mki67上調(diào)。NZM降低胞質(zhì)及線粒體ROS，恢復膜電位并提升OCR（圖5f–j）；MitoTracker示線粒體質(zhì)量增加，呼吸鏈復合體蛋白水平升高。線粒體調(diào)控蛋白SIRT1、PGC-1α、NRF1/2、mtTFA上調(diào)，p16、p21、p53下調(diào)（圖5k）。mt-mKeima檢測顯示NZM增強線粒體自噬，PHB表達升高（圖5l）。RNA-seq示NZM上調(diào)1 135、下調(diào)751個基因，PCA明顯分離；氧化磷酸化及TCA循環(huán)基因（mt-Atp6、Ndufa4l2）富集，衰老相關(guān)Cdkn1a下調(diào)，線粒體自噬基因同步上調(diào)（圖5m–o）。

圖5.（a–b）游離NAD?或NPs處理后MSC胞內(nèi)NAD?水平及NAD?/NADH比值，n=5；（c）胞內(nèi)ATP，n=5；（d）SA-β-Gal染色陽性率與圖像，標尺100 μm，n=4；（e）γH2AX、p21、p16免疫熒光，標尺10 μm，n=4；（f–g）MitoSOX熒光強度，標尺10 μm，n=5；（h–i）JC-1紅/綠比，標尺10 μm，n=5；（j）OCR基礎(chǔ)、最大及ATP偶聯(lián)呼吸，n=3；（k）Western blot示SIRT1、PGC-1α、mtTFA、NRF1/2及γH2AX、p16、p21、p53；（l）mt-mKeima報告線粒體自噬，標尺10 μm，n=5；（m）H?O?衰老模型?NZM差異基因熱圖，n=3；（n）氧化磷酸化與衰老相關(guān)基因火山圖（|log2FC|≥1，adjP<0.05）；（o）GSEA氧化磷酸化基因集富集

（6）NZM恢復骨質(zhì)疏松癥患者的骨再生能力和促進傷口愈合

體外衰老MSC經(jīng)NZM處理后堿性磷酸酶活性及鈣結(jié)節(jié)量顯著高于NAD?、ZIF-8或NZ組（圖6a–d），成骨蛋白與mRNA同步上調(diào)?？勺⑸渌z負載Cy5-NZM，3 dpi時熒光與巨噬細胞共定位，Ly6Chigh單核/巨噬細胞Cy5-MFI高于干細胞及其他細胞（圖6a、b）；14 dpi時熒光與干細胞共定位，干細胞Cy5-MFI反超其他細胞（圖6c、d）。骨質(zhì)疏松骨缺損模型中，NZM@Gel組4周骨愈合優(yōu)于空白凝膠及NZ@Gel組；NZM-CXCL12@Gel組BV/TV與BMD最高（圖6f、h）。微CT顯示骨量持續(xù)增加（圖6g）。4周后G5組H&E及Masson示結(jié)締組織與類骨組織最多（圖6i），病灶區(qū)NAD?及NAD?/NADH升高，OCN表達增強，ROS降低（圖6j）。流式示Ly6Chi促炎單核/巨噬細胞比例由≈84%降至≈62%，CD206? M2比例升高（圖6k、l）；免疫熒光示iNOS下調(diào)、ARG1上調(diào)。CXCL12協(xié)同NZM招募干細胞并減少CD45?免疫細胞浸潤，實現(xiàn)早期免疫調(diào)控與晚期干細胞功能恢復。全層皮膚缺損模型中，水凝膠負載NZM局部注射后滯留于創(chuàng)面，無全身擴散（圖6m）。NZM@Gel組（G3）愈合速度顯著快于未處理組（G1）及空白凝膠組（G2），NZM-CXCL12@Gel組（G4）再加速（圖6n）。組織學示G3/G4再上皮化增厚、真皮再生且瘢痕減少（圖6o）；Masson染色膠原沉積增加，G4新生毛囊數(shù)量最高。CD31免疫熒光顯示G3/G4血管密度升高，G4干細胞招募最多。5 dpi時，G3/G4創(chuàng)面CD45?浸潤減少，Ly6Chi單核/巨噬細胞比例下降，CD206?細胞比例上升；iNOS熒光減弱，ARG1增強（圖6p）。ELISA示IL-1β、IL-6、TNF-α下調(diào)，TGF-β、IL-10上調(diào)。結(jié)果表明，該平臺可序貫調(diào)控免疫、促進血管與基質(zhì)重塑，顯著加速創(chuàng)面愈合。

圖6.（a）3 dpi熒光示NZM富集巨噬，（b）流式驗證其跨細胞類型分布，n=5，標尺100 μm；（c）14 dpi熒光示NZM轉(zhuǎn)向干細胞，（d）流式示干細胞攝取增加，n=5，標尺100 μm；（e）骨質(zhì)疏松顱骨缺損實驗流程；（f）顱骨缺損CT代表性圖像，（g–h）2 w與4 w BV/TV及BMD定量，n=5；（i）4 周H&E與Masson染色，標尺200 μm；（j）OCN與DHE免疫熒光，標尺50 μm；（k–l）流式Ly6Chi M1比例與CD206 MFI，n=4；（m）皮膚創(chuàng)面實驗流程；（n）0–14 d創(chuàng)面面積圖像及定量，n=5，標尺2 mm；（o）H&E與Masson染色，標尺500 μm（d7）、400 μm（d14）；（p）治療后第5天創(chuàng)面TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1、IL-10水平，n=5