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針對上述挑戰(zhàn)，暨南大學(xué)郭瑞團(tuán)隊提出了一種“止血-降解-成骨”協(xié)同設(shè)計的新范式，開發(fā)出一種基于聚合物分散基質(zhì)的新型可生物降解骨蠟，即季銨化陽離子淀粉（QS）與β-磷酸三鈣（β-TCP）雙相促進(jìn)基質(zhì)（PST骨蠟）。該材料以QS和β-TCP為核心功能組分，其中QS憑借其高密度正電荷可靜電吸附紅細(xì)胞并激活血小板糖蛋白受體，同時其微孔結(jié)構(gòu)通過毛細(xì)作用富集凝血因子，顯著增強(qiáng)止血效能；β-TCP則模擬天然骨礦物質(zhì)組成，降解過程中持續(xù)釋放Ca2?和PO?3?離子，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化，并原位形成納米羥基磷灰石（HA）晶體，為新骨形成提供天然礦化支架。材料采用Poloxamer 188（P188）和PEG-PPG共聚物作為分散基質(zhì)，確保QS與β-TCP均勻分散，同時賦予材料類似傳統(tǒng)骨蠟的可塑性和黏附性，便于術(shù)中按壓填充，并調(diào)控降解速率以避免過載等副作用。體外實驗表明該骨蠟具有優(yōu)異的密封性與持久止血能力，體內(nèi)兔和比格犬模型驗證了其高效的止血效果與顯著的骨再生促進(jìn)作用，最終通過QS與β-TCP的協(xié)同作用實現(xiàn)了即時止血與長期骨修復(fù)的統(tǒng)一，展現(xiàn)出良好的生物相容性與臨床應(yīng)用前景。該文章以《Novel Bioresorbable Bone Wax for Potentiated Hemostasis and Osteogenesis》為題，于2025年10月13日發(fā)表于《Advanced Science》期刊（DOI: 10.1002/advs.202514616）。

合成的生物可吸收骨蠟止血和成骨材料示意圖。新型可吸收骨蠟的制備方法及其通過血細(xì)胞聚集加速凝血和促進(jìn)骨再生的機(jī)制

（1）PST骨蠟的合成表征

圖1A展示了季銨化陽離子淀粉（QS）的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（比例尺：10 μm），顯示其具有均勻的球形形貌；同時該圖還比較了不同組分骨蠟的表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)僅含β-TCP的PT骨蠟表面粗糙且疏松，而添加QS后的PST骨蠟則呈現(xiàn)出更均勻、致密的結(jié)構(gòu)，這有利于更好地封堵骨缺損處破裂的血管。圖1B提供了QS的粒徑分布測量結(jié)果，證實其粒子尺寸集中在4–10 μm范圍內(nèi)，為材料的均勻分散和功能發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)。圖1C展示了QS的Zeta電位測定結(jié)果，其值為14.5 ± 0.66 mV，歸因于其分子上的季銨鹽基團(tuán)所帶的穩(wěn)定正電荷，這種正電性有助于增強(qiáng)其在聚合物基質(zhì)中的分散穩(wěn)定性，并促進(jìn)紅細(xì)胞聚集以加強(qiáng)止血效果。為了評估材料的臨床可操作性，研究進(jìn)行了質(zhì)地分析，如圖1D所示為質(zhì)地分析的示意圖，模擬手指按壓揉捏時材料的抗壓阻力；對應(yīng)的圖1E展示了質(zhì)地分析曲線，結(jié)果顯示隨著QS和β-TCP含量的增加，PST骨蠟的初始硬度顯著提升，其中PST3樣品達(dá)到1.17 ± 0.18 N/mm，與強(qiáng)生（J&J）商用骨蠟相當(dāng)，且粘附變形從5.32 ± 0.58 mm顯著降低至2.49 ± 0.46 mm，最大粘附力也隨β-TCP增加降至約0.42 N，粘附能從3.1 ± 0.6 mJ大幅下降至約1 mJ，表明材料更不易粘連手術(shù)器械，具備理想的塑性和低黏性。此外，所有PST骨蠟均可快速塑形成均勻膏體，具有良好延展性。最后，為評估止血持久性，研究設(shè)計了骨髓毛細(xì)血管栓塞模擬實驗，其裝置示意圖見圖1F，對應(yīng)的圖1G展示了液體密封持續(xù)時間的結(jié)果：PT骨蠟密封時間約為4小時，加入QS后延長至約20小時，而隨著β-TCP含量增加，PST骨蠟的密封時間進(jìn)一步延長至近32小時，證明其具備優(yōu)異的長期封堵能力，能夠有效抵抗骨內(nèi)生理血壓，維持止血效果。綜上所述，該部分通過圖文結(jié)合的方式全面論證了PST骨蠟在微觀結(jié)構(gòu)、電學(xué)性質(zhì)、機(jī)械性能、加工性能及密封效能等方面的優(yōu)越特性，為其后續(xù)作為兼具高效止血與成骨誘導(dǎo)功能的多功能生物材料的應(yīng)用提供了堅實的理化基礎(chǔ)。

圖1.PST骨蠟的特性。A)掃描電子顯微鏡觀察可吸收骨蠟的表面形態(tài)(標(biāo)尺，10μm；QS：季銨鹽化陽離子淀粉；PT：含有僅含β-TCP的聚合物分散基質(zhì)的骨蠟；PSt：含有QS和β-TCP的聚合物分散基質(zhì)的骨蠟)。B)QS的粒度分布。C)Zeta勢OFP和QS(PS：預(yù)糊化淀粉)。D)骨蠟質(zhì)構(gòu)分析示意圖。E)骨蠟質(zhì)構(gòu)分析曲線。F)骨毛細(xì)血管壓力封閉的體外模擬示意圖。G)骨蠟液體封閉時間

（2）合成PST骨蠟的吸收和礦化行為

圖2A展示了PST系列骨蠟在輕微振蕩的PBS緩沖液中完全浸沒后的溶解行為，結(jié)果顯示隨著QS的初始添加和β-TCP含量的增加，溶解速率逐漸減慢，盡管材料在8小時內(nèi)完全溶解，表明其具有良好的可完全吸收性，同時QS和β-TCP的引入有效抑制了烷氧基共聚物在水中的快速完全溶解，防止骨蠟過早崩解。圖2B呈現(xiàn)了體外可吸收性測試結(jié)果，顯示PST骨蠟在48小時內(nèi)緩慢溶解10–20%，而在28天內(nèi)降解率超過80%，并殘留一定量的礦化粉末，證明其具備可控且持久的降解特性。為追蹤聚合物基質(zhì)的降解情況，研究對降解過程中第1、4、7和10天的PBS上清液進(jìn)行了FT-IR分析（圖2C），發(fā)現(xiàn)PEG-PPG和P188的特征振動峰（-CH伸縮、-CH彎曲、-CO伸縮）僅在前7天可檢測到，且透射強(qiáng)度持續(xù)下降，至第10天已低于檢測限，表明聚合物分散基質(zhì)在10天內(nèi)幾乎完全降解。圖2D和2E通過ICP-MS分析了Ca2?和PO?3?離子的釋放動力學(xué)：Ca2?釋放量在初始添加QS時無顯著變化（最低2.67 ± 0.30 mg L?1），但隨著β-TCP含量增加，每日釋放量提升0.23–0.43 mg L?1，21天后累積達(dá)7.62 ± 0.42 至 14.53 ± 0.72 mg L?1；PO?3?釋放趨勢類似，初始不變，隨β-TCP增加日均釋放4.99–7.09 mg L?1，21天后達(dá)186.0 ± 11.07 至 288.60 ± 15.8 mg L?1，證實β-TCP是礦化離子的主要來源。此外，pH監(jiān)測顯示PST骨蠟降解過程中pH值在7天內(nèi)從7.41–7.49輕微下降至7.35–7.43，隨后兩周回升至7.41–7.54并保持穩(wěn)定，變化始終處于生理中性范圍，且不受淀粉含量影響，說明材料降解不會引起局部酸化，生物安全性良好。進(jìn)一步通過SEM觀察PST骨蠟隨時間的相組成演變（圖2F），發(fā)現(xiàn)降解過程中有1–3 μm的微粒從溶液中析出，聚合物基質(zhì)逐漸消失，留下QS和β-TCP殘余。特別地，圖2G展示了21天后殘留物的SEM圖像及EDS元素映射，顯示均質(zhì)化的QS（黃色）帶有孔隙，并附著大量聚集的納米晶體（綠色）、棒狀、撕裂片狀和針狀晶體（藍(lán)色），EDS確認(rèn)Ca和P為主要元素，表明形成了磷酸鈣類礦化產(chǎn)物。XRD分析（圖2H）進(jìn)一步證實，在7、14和21天時均可觀察到羥基磷灰石（HA）的特征衍射峰，且峰強(qiáng)度隨時間增強(qiáng)，表明PST骨蠟在降解過程中持續(xù)向HA轉(zhuǎn)化。尤為關(guān)鍵的是，Scherrer公式計算顯示（圖2I），HA晶體尺寸在初始添加QS后顯著從5.96 ± 1.5 nm增長至20.37 ± 4.56 nm，且XRD譜圖顯示21天后HA衍射峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，揭示QS不僅自身不降解，反而顯著加速了HA的成核與晶體生長，促進(jìn)功能性礦化。

圖2.PST骨蠟的吸收和礦化行為。A)骨蠟在PBS中的溶解度(紅圈標(biāo)記未完全塌陷的骨蠟)。(2)骨蠟吸收28天內(nèi)的殘余質(zhì)量曲線。C)PST骨蠟吸收10天的FT-IR光譜。D)PST骨蠟吸收過程中鈣離子和E)PO43?的釋放。F)骨吸收后1、7、14、21天(標(biāo)尺，10μm)掃描電子顯微鏡觀察PST骨蠟的殘留成分。G)骨吸收21d后PST骨蠟的元素分布和掃描電子顯微鏡假彩色圖像(黃色：QS；綠色：β-Tcp；藍(lán)色：β-Tcp礦化的羥基磷灰石；標(biāo)尺，5μm)。H)PST骨蠟在21天的吸收過程中的X射線衍射，羥基磷灰石的特征峰(PDF參考文獻(xiàn))。09-0432)。1)基于Korsmeyer-Peppas模型的羥基磷灰石晶相參數(shù)的擬合

（3）PST骨蠟的細(xì)胞相容性和成骨性能性能

通過活/死細(xì)胞染色法檢測BMSCs在1、3、5天后的存活狀態(tài)（圖3A），結(jié)果顯示所有PST骨蠟組均表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞相容性，死細(xì)胞極少，且隨著β-TCP含量增加，細(xì)胞增殖密度顯著提高，表明材料無細(xì)胞毒性并能促進(jìn)細(xì)胞生長。進(jìn)一步通過CCK-8法評估BMSCs在7天內(nèi)的細(xì)胞活力（圖3E），發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，經(jīng)PST骨蠟處理的BMSCs相對細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，且該促進(jìn)作用隨β-TCP含量升高而加強(qiáng)，證實其對細(xì)胞代謝活性具有積極影響。此外，細(xì)胞遷移實驗顯示，在48小時內(nèi)，隨著β-TCP含量的增加，BMSCs的遷移面積明顯擴(kuò)大（圖3B,F），進(jìn)一步驗證了PST骨蠟組分對細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用，強(qiáng)化了其良好的生物相容性和促修復(fù)潛力。為評價鈣鹽沉積效率和成骨分化能力，研究進(jìn)行了堿性磷酸酶（ALP）染色（代表早期成骨分化）和茜素紅S（ARS）染色（代表無機(jī)鈣結(jié)節(jié)形成）。結(jié)果表明，添加QS并提高β-TCP含量的PST骨蠟顯著增強(qiáng)了BMSCs的ALP活性，尤其以PST3組最為突出（圖3C,G）。同樣，ARS染色顯示PST骨蠟促進(jìn)了更多礦化結(jié)節(jié)的形成，其中PST3組的礦化程度最高（圖3D,H），說明該材料具備強(qiáng)大的誘導(dǎo)礦化能力。為進(jìn)一步從基因?qū)用娲_認(rèn)成骨促進(jìn)效應(yīng)，采用RT-PCR分析BMSCs中成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PST骨蠟?zāi)軌蛞驭?TCP濃度依賴的方式上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）、I型膠原蛋白（COL1）和ALP的mRNA表達(dá)，且初始添加QS進(jìn)一步增強(qiáng)了這一上調(diào)作用（圖3I），表明QS與β-TCP協(xié)同強(qiáng)化了成骨信號通路。免疫熒光染色針對成骨標(biāo)志蛋白OPN的結(jié)果與此一致，PST3組顯示出最強(qiáng)的OPN蛋白表達(dá)熒光信號（圖3J,K），從蛋白水平再次驗證了成骨分化的增強(qiáng)。綜合來看，這些結(jié)果通過多維度實驗充分證明PST骨蠟不僅具有卓越的細(xì)胞相容性，還能有效促進(jìn)BMSCs的增殖、遷移和成骨分化，其機(jī)制主要歸因于降解過程中持續(xù)釋放的Ca2?和PO?3?離子（結(jié)合圖2D,E），最終實現(xiàn)“止血-降解-成骨”的功能一體化設(shè)計（圖3L）。

圖3.PST骨蠟的細(xì)胞相容性和成骨性能。A)用骨蠟提取液培養(yǎng)1、3、5天的BMSCs進(jìn)行活/死實驗?；罴?xì)胞顯示為綠色，死亡細(xì)胞顯示為紅色(比例尺，200μm)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)骨蠟提取液培養(yǎng)24和48h后的細(xì)胞遷移(標(biāo)尺，400μm)。C)堿性磷酸酶染色：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨蠟提取物共培養(yǎng)14d(標(biāo)尺，上1 cm；下500μm)。D)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨蠟提取物共培養(yǎng)21d(標(biāo)尺，上1 cm；下500μm)進(jìn)行ARS染色。用CCK-8檢測骨蠟提取物對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。F)骨蠟提取液培養(yǎng)24 h和48 h的BMSCs細(xì)胞遷移面積的定量分析。H)ARS染色的鈣結(jié)節(jié)的定量分析。1)骨蠟提取液培養(yǎng)14天的BMSCs成骨基因表達(dá)水平。(J)骨蠟提取物培養(yǎng)14天的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨橋蛋白的免疫熒光染色(標(biāo)尺，10μm)。K)定量分析OPN熒光強(qiáng)度。L)示意圖，闡明了骨蠟促進(jìn)BMSCs增殖和成骨的機(jī)制

（4）PST骨蠟的血液相容性和凝血性能

圖4A示意圖展示了PST骨蠟的止血過程：其季銨化陽離子淀粉（QS）所帶正電荷與β-TCP釋放的Ca2?協(xié)同作用，促進(jìn)紅細(xì)胞（RBCs）聚集和血小板（PLTs）激活，從而加速血凝塊形成。為評估血液相容性，進(jìn)行溶血實驗，結(jié)果顯示所有PST骨蠟組的溶血率均低于5%（圖4B），符合生物材料安全標(biāo)準(zhǔn)，證實其良好的血液相容性。在體外全血凝血實驗中，通過檢測上清液中血紅蛋白（HGB）吸光度來反映未參與凝集的RBC數(shù)量，所有骨蠟組均表現(xiàn)出促凝效果，上清液比對照組更澄清；隨著QS和β-TCP含量增加，血液聚集能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為更低的吸光度值（PST3 < PST2 < PST1 < PT1），其中PST3在20分鐘內(nèi)即實現(xiàn)完全凝血，吸光度接近零且上清液幾乎透明，而缺乏QS的PT骨蠟促凝效果明顯較弱，突顯QS在增強(qiáng)促凝活性中的關(guān)鍵作用（圖4C,D）。進(jìn)一步通過掃描電鏡（SEM）觀察PST骨蠟對RBCs聚集和PLTs黏附/活化的影響，結(jié)果顯示：與紗布對照組僅有零星RBC黏附相比，PT組在β-TCP周圍出現(xiàn)更多RBC聚集；而添加QS的PST骨蠟則展現(xiàn)出顯著更強(qiáng)的RBC聚集能力，且聚集程度隨β-TCP含量升高而增加（圖4E）。在血小板行為方面，PT組已表現(xiàn)出明顯的PLTs在β-TCP上的黏附與激活，而PST骨蠟因含QS進(jìn)一步顯著增強(qiáng)了PLTs的黏附；PLTs形態(tài)從靜息態(tài)的“雙凸盤狀”轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ詈蟮摹靶切巍睒渫粻?，偽足延伸并鋪展于QS表面，最終形成由交織偽足和纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的“蜂窩狀”結(jié)構(gòu)，表明PST骨蠟?zāi)苡行Ъせ畈⒕奂“澹▓D4F）。此外，乳酸脫氫酶檢測顯示PST組非黏附血小板數(shù)量顯著減少，進(jìn)一步驗證其卓越的血小板聚集能力；鈣離子熒光檢測顯示PST組胞內(nèi)Ca2?水平（熒光強(qiáng)度）高于對照組和PT組（圖4G），表明其誘導(dǎo)了更強(qiáng)的血小板激活。為進(jìn)一步評估體外止血性能，采用血凝指數(shù)（BCI）實驗，結(jié)果顯示無論是否添加CaCl?，所有PST骨蠟的BCI值均顯著低于紗布對照組，且隨QS和β-TCP含量增加而降低；特別是PST2和PST3在有無CaCl?條件下BCI值相近，表明其止血功能不依賴外源性凝血因子，具有獨立于凝血系統(tǒng)的止血能力；其中PST3的BCI值最低，止血性能最優(yōu)。最后，活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶原時間（PT）測試表明，與對照組和PT骨蠟相比，添加QS并提高β-TCP含量顯著縮短了APTT，而PT無顯著差異（圖4H,I），提示PST骨蠟主要通過激活內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮促凝作用。

圖4.PST骨蠟的血液相容性和血細(xì)胞聚集特性。A)PST骨蠟促進(jìn)紅細(xì)胞聚集和血小板活化的示意圖。B)PST骨蠟溶血試驗(TX-100：Triton X-100)。C)在紅細(xì)胞懸液中與PST骨蠟共同孵育20分鐘后的紅細(xì)胞聚集。D)PST骨蠟與稀釋的紅細(xì)胞懸液共同孵育20分鐘后上清液中HGB含量。E)PST骨蠟聚集紅細(xì)胞的掃描電子顯微鏡偽彩色圖像(比例尺，10μm)。掃描電子顯微鏡下PST骨蠟(標(biāo)尺，10μm)及其局部放大圖像(標(biāo)尺，2μm；紅色：紅細(xì)胞，藍(lán)色：β-Tcp，黃色：QS，紫色：PLT，橙色：纖維蛋白包裹的β-Tcp)的血小板聚集和激活的掃描電子顯微鏡偽彩色圖像。(G)PST骨蠟激活的PLT細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度。H)PST骨蠟APTT試驗。1)PST骨蠟PT試驗

（5）PST骨蠟的體內(nèi)止血和促進(jìn)成骨作用

進(jìn)一步地，通過兔脛骨松質(zhì)骨缺損模型系統(tǒng)評估了PST骨蠟的體內(nèi)止血與成骨修復(fù)能力。首先，實驗建立了兔脛骨缺損模型，并在術(shù)后即刻及術(shù)后第1、4、7天采集血液樣本以評估止血效果和全身反應(yīng)（圖5A）。術(shù)中應(yīng)用PST骨蠟后，缺損部位出血立即停止；與紗布對照組在3分鐘內(nèi)失血達(dá)2.32 ± 1.2 mL相比，所有骨蠟組均幾乎無血液流失；尤為突出的是，商用J&J骨蠟在3分鐘后仍存在輕微滲血，而所有PST骨蠟組均在3分鐘內(nèi)完全實現(xiàn)止血，這歸因于其優(yōu)異的可塑性和黏附性，能夠有效封閉骨髓裂隙和竇狀隙，阻斷血流（圖5B,C）。術(shù)后監(jiān)測外周血指標(biāo)顯示，所有組別的血紅蛋白（HGB）水平均維持在正常范圍（80–160 g L?1），但PST3組在術(shù)后第4天和第7天的HGB水平顯著高于空白組和其他骨蠟組（圖5H），表明其術(shù)中出血更少，有利于術(shù)后HGB的恢復(fù)與生成。血小板（PLT）水平方面，各組在術(shù)后第1天均升高以促進(jìn)初期止血，隨后逐漸回落至正常范圍（150–400×10? L?1）；其中PST1和PST3組恢復(fù)最快，提示其能更有效地控制持續(xù)性出血并維持血液穩(wěn)態(tài)，而PT1組在第4天出現(xiàn)PLT異常升高，可能提示存在短暫的繼發(fā)性出血（圖5I）。此外，通過監(jiān)測白細(xì)胞（WBC）及其亞群（淋巴細(xì)胞Lym、嗜酸性粒細(xì)胞Eos、中性粒細(xì)胞Neu）評估術(shù)后炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示紗布組WBC顯著升高，而商用J&J骨蠟組的WBC、Lym、Eos和Neu均超出正常生理范圍，表明引發(fā)明顯炎癥反應(yīng)；相比之下，PT、PST1和PST3骨蠟組各項指標(biāo)均保持在正常范圍內(nèi)（圖5J–M），證明其具有良好的生物相容性且無短期免疫排斥。為進(jìn)一步評估長期骨修復(fù)能力，術(shù)后4周和8周取脛骨樣本進(jìn)行組織學(xué)與影像學(xué)分析。H&E和Masson染色結(jié)果顯示（圖5D,E），空白組和J&J骨蠟組在第4周時缺損區(qū)存在大量炎癥細(xì)胞（黃色三角標(biāo)記），第8周仍可見部分殘留；且J&J骨蠟因不可降解導(dǎo)致明顯的纖維組織包裹（白色三角標(biāo)記），持續(xù)阻礙新骨形成；而PT、PST1和PST3組炎癥細(xì)胞極少。更重要的是，PST骨蠟組顯著促進(jìn)骨再生：術(shù)后4周，PT1、PST1和PST3組已形成具有不規(guī)則孔隙的新生小梁骨網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（紅色三角標(biāo)記），其中PST3組骨網(wǎng)絡(luò)最致密；至第8周，該結(jié)構(gòu)進(jìn)一步成熟為致密的皮質(zhì)骨。免疫組化定量分析成骨標(biāo)志物OCN、OPN和RUNX2的表達(dá)，結(jié)果顯示PST骨蠟組顯著高于空白組和J&J組（圖5P–R），進(jìn)一步證實其卓越的骨再生能力。同時，對炎癥與免疫調(diào)控相關(guān)因子TNF-α和IL-6的檢測顯示（圖5F,G），J&J骨蠟組在第4周呈現(xiàn)明顯陽性表達(dá)，紗布組也有一定表達(dá)（可能因持續(xù)出血所致），而PT、PST1和PST3組則無顯著表達(dá)；定量分析進(jìn)一步證實J&J組TNF-α和IL-6陽性面積百分比顯著高于紗布組和PST3組（圖5N,O），結(jié)果與H&E染色一致，表明PST骨蠟在骨再生過程中引發(fā)極低的炎癥與免疫反應(yīng)。此外，PST骨蠟組的血液學(xué)與生化指標(biāo)均在正常范圍，心、肝、脾、肺、腎的H&E染色也顯示正常組織結(jié)構(gòu)，充分驗證其體內(nèi)生物安全性。

圖5.兔松質(zhì)骨缺損模型中PST骨蠟的治療。A)PST骨蠟在兔脛骨缺損模型中的應(yīng)用示意圖。B)術(shù)中使用不同骨蠟對骨缺損處止血的數(shù)字圖像。C)在缺損處涂抹骨蠟后3分鐘內(nèi)失血。D)用不同的骨蠟處理4周后的骨切片進(jìn)行HE染色(標(biāo)尺，1000μm)，并放大缺損區(qū)的視野(標(biāo)尺，100μm；黃色三角形，炎性細(xì)胞；紅色三角形，新骨組織)。E)4周后取骨切片進(jìn)行Masson三色染色(標(biāo)尺，100μm；白色三角形，肌纖維)。F)和G)治療4周后取骨切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。H)治療后7天內(nèi)全血標(biāo)本中HGB、I)PLT、J)WBC、K)LYM、L)EOS和M)Neu含量的變化。N)腫瘤壞死因子-α，O)IL-6，P)OCN，Q)OPN，R)RUNX2免疫組織化學(xué)染色定量

進(jìn)一步，利用micro-CT技術(shù)對骨再生過程進(jìn)行了全面量化分析。圖6A展示了術(shù)后第4周和第8周各組兔子脛骨的micro-CT三維重建圖像（比例尺：5 mm），結(jié)果顯示從術(shù)后第4周起，除強(qiáng)生（J&J）商用骨蠟組外，所有實驗組均表現(xiàn)出新骨從缺損邊緣向中心逐漸長入的趨勢；而J&J骨蠟組在第8周仍存在持續(xù)性骨空腔，甚至出現(xiàn)異位骨增生現(xiàn)象，表明其不可降解特性嚴(yán)重阻礙了正常骨愈合進(jìn)程。相比之下，PST3骨蠟組在第8周即實現(xiàn)缺損區(qū)域的完全修復(fù)，形成致密的新骨結(jié)構(gòu)，顯著優(yōu)于空白對照組、PT1組和PST1組，凸顯其卓越的骨再生能力。進(jìn)一步通過冠狀面和橫斷面的micro-CT切片圖像（圖6B,C）顯示，PST各組的缺損區(qū)域明顯縮小，骨密度顯著增加，而對照組則仍存在未愈合的空腔，直觀反映了PST骨蠟對骨組織再生的促進(jìn)作用；大體標(biāo)本觀察也證實PST處理的缺損區(qū)表面光滑完整。在定量分析方面，圖6D展示了骨礦密度（BMD）的測量結(jié)果，PST骨蠟表現(xiàn)出隨QS和β-TCP含量增加而增強(qiáng)的成骨效應(yīng)：PST3組在術(shù)后4周和8周的BMD分別達(dá)到0.30 ± 0.01 g/cm3和0.34 ± 0.01 g/cm3，顯著高于空白對照組的0.23 ± 0.02 g/cm3和0.27 ± 0.01 g/cm3，表明其能更快地實現(xiàn)骨質(zhì)礦化。此外，圖6E–G分別展示了骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）的統(tǒng)計結(jié)果，三者均隨著PST骨蠟中QS和β-TCP含量的增加而持續(xù)升高，說明新形成的骨組織不僅體積更大，且微觀結(jié)構(gòu)更加致密和成熟。

圖6.PST骨蠟再生能力的放射學(xué)評估。A)植入后4周和8周兔脛骨缺損處的Micro-CT三維重建圖像(藍(lán)色圓圈，直徑4 mm)。B)冠狀和C)脛骨缺損區(qū)的橫斷面顯微CT圖像(比例尺，4 mm；藍(lán)色箭頭，骨缺損區(qū))。D)骨密度(BMD)，E)骨體積/總體積(BV/Tv)，F(xiàn))骨小梁數(shù)量(Tb.N)，G)骨小梁厚度(Tb.Th)。每組n≥3。誤差條表示平均值±SD；*p<；0.05、**p<；0.01和*p<；0.001

進(jìn)一步驗證其PST骨蠟在大動物體內(nèi)的多功能療效。首先，圖7A展示了實驗設(shè)計示意圖，即在比格犬脛骨建立松質(zhì)骨缺損模型，作為關(guān)鍵的臨床前研究模型；在術(shù)中止血評估中，PST3組在3分鐘內(nèi)出血量僅為0.69 ± 0.47 mL，顯著優(yōu)于紗布對照組（5.0 ± 0.5 mL）和強(qiáng)生（J&J）骨蠟組（1.6 ± 0.62 mL），表明其具有卓越的快速止血能力。在高生理血壓條件下，PST3能在3分鐘內(nèi)完全控制出血且材料無崩解，而J&J骨蠟仍有輕微滲血，紗布組則持續(xù)出血（圖7B）。術(shù)后第1天，PST3組傷口滲出量顯著低于J&J骨蠟組（3.8 ± 0.81 mL）和空白對照組（8.6 ± 0.56 mL），至第7天仍維持較低水平（PST3: 0.3 ± 0.27 mL vs 空白: 5.1 ± 0.71 mL），證實其能有效抑制頑固性骨缺損出血；同時，空白對照組在第7天出現(xiàn)明顯腫脹，J&J組為輕度腫脹，而PST3組無腫脹，進(jìn)一步驗證其持久止血效果。為評估骨再生能力，于術(shù)后6周和12周取材進(jìn)行顯微CT（micro-CT）分析，代表性3D重建圖像顯示（圖7G,H），各組（空白、J&J骨蠟、PST3）缺損修復(fù)隨時間進(jìn)展，其中PST3組在12周時已形成致密的網(wǎng)狀小梁骨橋接結(jié)構(gòu)并實現(xiàn)皮質(zhì)骨完全覆蓋；而空白對照組在6周時缺損仍暴露，12周時僅有松散排列的小梁部分填充缺損；尤為關(guān)鍵的是，不可降解的J&J骨蠟因阻礙組織長入而完全抑制新骨形成。進(jìn)一步對橫斷面進(jìn)行micro-CT分析（圖7I,J）顯示，空白對照組在6周時（Transverse-2層面）仍存在持續(xù)性骨空腔，僅在Transverse-1和-3層面有有限的骨痂形成，而PST3組在冠狀面和橫斷面均實現(xiàn)了更優(yōu)的缺損填充密度。定量骨形態(tài)計量學(xué)分析一致證實，PST3組的新骨體積和骨礦密度顯著高于各對照組（圖7C–F）。大體標(biāo)本觀察結(jié)果與影像學(xué)一致：空白組仍可見明顯缺損，J&J組出現(xiàn)異位纖維組織包封，而PST3組則形成光滑的皮質(zhì)骨表面，無過度異位組織增生，這歸因于其可生物降解性及內(nèi)在的成骨能力。隨后，清除脛骨周圍肌肉組織后，對骨樣本進(jìn)行H&E和Masson染色組織學(xué)分析，結(jié)果顯示（圖7K,L）：J&J骨蠟在6周和12周均引發(fā)大量與炎癥相關(guān)的細(xì)胞浸潤（黃三角），并出現(xiàn)進(jìn)行性纖維包封（白三角），表明其生物相容性差；相反，PST3組因固有的可降解性，在6周時炎癥反應(yīng)輕微，至12周時已發(fā)展為正常的組織形態(tài)（有序的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無炎癥細(xì)胞）并形成復(fù)雜交織的骨結(jié)構(gòu)（紅三角）。

圖7.在Beagle松質(zhì)骨缺損模型中PST骨蠟的治療。A)PST骨蠟在Beagle脛骨骨缺損模型中的應(yīng)用示意圖。B)術(shù)中使用不同的骨蠟在骨缺損部位止血的數(shù)字圖像。C)BV/TV，D)骨表面與總體積之比(BS/TV)，E)Tb.N，F(xiàn))Tb.Th基于Micro-CT的分析。G)植入后12周(藍(lán)色圓圈，直徑4 mm)的Beagle脛骨缺損區(qū)的MicroCT三維重建圖像，顯示缺損區(qū)的放大圖像(比例尺，1 mm)。I)和J)6周和12周脛骨缺損區(qū)的冠狀位和橫斷位的顯微CT圖像(標(biāo)尺，4 mm；藍(lán)色箭頭，骨缺損區(qū))。(K)用不同的骨蠟(鱗片，1000μm)和缺損區(qū)放大觀察(鱗片，100μm；黃色三角形，炎性細(xì)胞；紅色三角形，新骨組織；白色三角形，肌纖維)治療6周和(L)12周后的骨切片進(jìn)行H&E和Masson三色染色。每組n≥3。誤差條表示平均值±SD；*p<；0.05、**p<；0.01和*p<；0.001

（6）PST骨蠟實現(xiàn)卓越止血效果的多階段協(xié)同凝血機(jī)制討論

如圖8所示，PST骨蠟的止血過程被歸納為一個多層次的凝血級聯(lián)反應(yīng)：在凝血啟動階段，帶正電荷的季銨化陽離子淀粉（QS）表面（由圖1C中Zeta電位14.5 ± 0.66 mV證實其穩(wěn)定正電性）能夠吸附組織因子（TF）和骨膠原，促進(jìn)TF-VIIa復(fù)合物的形成，進(jìn)而催化因子X向Xa的轉(zhuǎn)化；與此同時，QS直接激活血小板（PLTs），驅(qū)動其形態(tài)從靜息態(tài)的雙凹圓盤狀轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨臉渫粻罨蚍涓C狀結(jié)構(gòu)（這一形態(tài)轉(zhuǎn)變在圖4F的SEM圖像中以紫色/橙色高亮清晰展示），并伴隨磷脂酰絲氨酸暴露和ADP釋放的增強(qiáng)，從而放大凝血信號。進(jìn)入凝血擴(kuò)增階段，β-TCP降解過程中持續(xù)釋放的Ca2?離子（其釋放動力學(xué)由圖2D的ICP-MS數(shù)據(jù)定量呈現(xiàn)）作為關(guān)鍵輔因子，激活血小板表面的VIIIa-Xa復(fù)合物，催化“凝血酶爆發(fā)”（thrombin burst），顯著加速凝血進(jìn)程。在凝血放大階段，Ca2?進(jìn)一步介導(dǎo)纖維蛋白原交聯(lián)形成纖維蛋白，最終在PST骨蠟表面構(gòu)建致密的血凝塊網(wǎng)絡(luò)。這種由QS和β-TCP協(xié)同驅(qū)動的多級聯(lián)機(jī)制產(chǎn)生了顯著的生理效應(yīng)：在大型哺乳動物模型中實現(xiàn)了即時且持久的止血效果，即使在120–160 mmHg的高生理血壓下仍能維持結(jié)構(gòu)完整性，無滲漏（圖7B）；體外實驗顯示活化部分凝血活酶時間（APTT）顯著縮短，證實內(nèi)源性凝血途徑被有效激活（圖4H）；術(shù)后第7天引流量極低（0.3 ± 0.27 mL），邊緣無滲出，表明其密封性能優(yōu)異。

圖8.PST骨蠟利用其帶電表面和受控的鈣釋放，在骨出血部位局部快速啟動、傳播和放大整個凝固級聯(lián)，從而實現(xiàn)卓越的防滲漏止血。