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為了解決上述問題，北京大學(xué)周方和北京航空航天大學(xué)劉海峰聯(lián)合團隊以聚多巴胺包被氧化鈰納米顆粒負(fù)載鎂離子，嵌入甲基丙烯?；髂z（GelMA）水凝膠，構(gòu)建可光交聯(lián)的多功能支架。該復(fù)合體系兼具抗氧化、抗炎、促成骨與促血管生成能力，系統(tǒng)驗證體外細(xì)胞相容性及生物活性后，在骨質(zhì)疏松大鼠顱骨缺損模型中證實其顯著加速骨再生，為骨質(zhì)疏松骨缺損修復(fù)提供新策略。該文章于2025年8月28日以《Multifunctional Nanoparticle Reinforced GelMA Hydrogel for Osteoporotic Pathophysiological Microenvironment Improvement and Bone Defect Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202505063）。

圖1 PDA@CeO₂-Mg納米復(fù)合材料的制備示意圖及體內(nèi)外實驗步驟。A）PDA@CeO₂-Mg復(fù)合納米粒子的合成。B）GelMA(PDA@CeO₂-Mg)納米復(fù)合水凝膠的免疫誘導(dǎo)、成骨和血管生成特性。C）GelMA(PDA@CeO₂-Mg)納米復(fù)合水凝膠的體內(nèi)骨修復(fù)能力

（1）不同納米粒子和納米復(fù)合水凝膠的合成與表征

合成的C、CP及CPM納米顆粒經(jīng)SEM和TEM觀察均呈現(xiàn)規(guī)則形貌與均一粒徑分布，CeO₂顆粒表面可見一層薄膜包覆（圖2A、B）。FTIR分析顯示，CP和CPM在1610 cm^-1處出現(xiàn)C ═ C伸縮振動與N-H彎曲振動特征峰，證明PDA成功修飾于CeO₂表面；在CPM中，還觀察到≈500 cm^-1的Mg-O特征峰及≈1396 cm^-1的Mg(OH)2分子振動峰，表明Mg²⁺成功負(fù)載于PDA@CeO₂顆粒（圖2C）。EDS元素映射進(jìn)一步證實Ce、O及Mg均勻分布，說明納米復(fù)合結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定（圖2D、E）。此外，GelMA (G)、GelMA(CeO₂) (GC)、GelMA(PDA@CeO₂) (GCP)、GelMA(PDA@CeO₂-Mg) (GCPM)水凝膠均可通過紫外交聯(lián)成功制備。SEM結(jié)果顯示，各類水凝膠內(nèi)部均呈現(xiàn)相互連通、分布均一的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑范圍在100–400 μm之間，且引入C、CP及CPM納米顆粒后水凝膠結(jié)構(gòu)更加致密，但孔徑未發(fā)生顯著變化（圖2F）。該孔徑范圍被認(rèn)為適合骨組織工程應(yīng)用，有利于干細(xì)胞黏附、增殖及營養(yǎng)交換。

圖2 不同納米粒子和納米復(fù)合水凝膠的表征。A) C、CP 和 CPM 納米粒子的代表性 SEM 圖像。B) C、CP 和 CPM 納米粒子的代表性 TEM 圖像。C) C、CP 和 CPM 納米粒子的 FTIR 圖像。D、E) C 和 CPM 納米粒子的代表性 EDS 圖像。F) G、GC、GCP 和 GCPM 水凝膠的代表性 SEM 圖像

EDS結(jié)果顯示，GC、GCP和GCPM水凝膠中C、N、O和Ce元素分布均勻，且GCPM中檢測到Mg元素（圖3A、B），表明各類納米顆粒成功摻入GelMA水凝膠。FTIR分析顯示1650 cm^-1處為C=O伸縮峰，1377 cm^-1為CH₂特征峰，1406 cm^-1為 = C-H峰，550 cm^-1為Ce–O伸縮峰，證實GC、GCP和GCPM均含有CeO?顆粒（圖3C）。水凝膠在24 h動態(tài)觀察下均表現(xiàn)出良好的溶脹性能（圖3D）。力學(xué)測試結(jié)果表明，水凝膠壓縮應(yīng)力隨C、CP及CPM納米顆粒的加入逐漸增強，其中GCPM最高（圖3E、F）。流變學(xué)分析顯示所有水凝膠的儲能模量（G′）均高于損耗模量（G″），表明形成穩(wěn)定的彈性網(wǎng)絡(luò)；與純GelMA相比，GC、GCP和GCPM的G′明顯升高，其中GCPM增加最顯著（圖3G–K）。降解實驗顯示，所有水凝膠隨時間逐漸降解，純GelMA降解速率最快，而含納米顆粒的水凝膠降解較慢（圖3L）。元素釋放實驗表明，所有水凝膠均可穩(wěn)定釋放Ce元素，且GCPM能有效釋放Mg離子（圖3M、N）。

圖3 不同納米復(fù)合水凝膠的表征。A、B）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝膠的代表性 EDS 圖像。C）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝膠的 FTIR。D）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝膠的動態(tài)溶脹行為。E、F）不同水凝膠在壓縮狀態(tài)下的應(yīng)力-應(yīng)變曲線以及測量各種水凝膠的壓縮模量。G-K）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝膠從 0.1 到 100 rad s^-1的流變頻率掃描。L）G、GC、GCP 和 GCPM 水凝膠隨時間的降解率。M、N）。Ce 和 Mg 釋放曲線。 G：GelMA，GC：GelMA(CeO₂ )，GCP：GelMA(PDA@CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@CeO₂-Mg)

（2）體外生物相容性評價

良好的細(xì)胞相容性是生物材料應(yīng)用的基本前提。首先進(jìn)行活/死熒光染色以評估納米復(fù)合水凝膠的毒性。如圖4 A所示，僅觀察到極少量的死細(xì)胞，在第1 天和第 3 天的所有組中大多數(shù)細(xì)胞仍然存活，表明復(fù)合水凝膠是細(xì)胞友好的。為了進(jìn)一步評估細(xì)胞增殖，進(jìn)行了 CCK-8 檢測。根據(jù) CCK-8 結(jié)果（圖 4B，C），在 G，GC，GCP 和 GCPM 水凝膠中，BMSCs 的增殖沒有顯著差異。此外，還通過細(xì)胞骨架染色觀察了與不同水凝膠共培養(yǎng)的 BMSCs 的形態(tài)。如圖 4D所示，BMSCs 充分伸展并伸出觸手。這些結(jié)果表明復(fù)合水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性，支持其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的潛力。

圖4 體外生物相容性評估。A）第 1 天和第 3 天對 BMSCs 進(jìn)行活死染色。B、C）第 1 天和第 3 天的 CCK-8 分析。D）第 1 天和第 3 天在不同納米復(fù)合水凝膠上 BMSCs 的 F-actin 和細(xì)胞核的代表性熒光圖像。結(jié)果以平均值±SD 表示。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。G：GelMA，GC：GelMA(CeO₂)，GCP：GelMA(PDA@CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@CeO₂-Mg)

（3）體外ROS清除能力評價

在H₂O₂誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境下，BMSCs在HG組中出現(xiàn)大量死亡細(xì)胞，而HGC、HGCP及HGCPM組死亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖5A、B），提示納米復(fù)合水凝膠對BMSCs具有保護(hù)作用。CCK-8檢測顯示，HG組BMSCs增殖能力顯著下降，而HGC、HGCP及HGCPM組的增殖水平均較HG組有所恢復(fù)（圖5C、D），進(jìn)一步表明這些水凝膠在氧化應(yīng)激下改善了細(xì)胞活性。DCFH-DA染色結(jié)果顯示，HG組ROS熒光信號最強，sham組最弱，而HGC、HGCP及HGCPM組均顯著降低ROS信號（圖5E）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致，HGC、HGCP及HGCPM組細(xì)胞ROS熒光強度顯著低于HG組（圖5F、G），證實其具有有效的ROS清除能力。JC-1染色結(jié)果顯示，HG組紅色熒光明顯減弱、綠色熒光增強，提示線粒體膜電位下降；而HGC、HGCP及HGCPM組紅色熒光增強、綠色熒光減弱，表明線粒體膜電位得到恢復(fù)（圖5H），說明水凝膠可通過清除ROS維持線粒體功能。

圖5 體外ROS清除能力評估。A、B）用不同水凝膠在H₂O₂ 條件下處理1天和3天的BMSC的活/死染色。C、D）用不同水凝膠在H₂O₂條件下處理1天和3天的BMSC的CCK-8分析。E）BMSC細(xì)胞內(nèi)ROS的代表性圖像。F、G）DCFH-DA染色的BMSC細(xì)胞內(nèi)ROS的流式細(xì)胞術(shù)圖像。H）通過JC-1染色中的綠/紅百分比確定BMSC的MMP。結(jié)果以平均值±SD表示。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。 S：Sham，HG：H₂O₂ GelMA，HGC：H₂O₂ GelMA(CeO₂)，HGCP：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂)，HGCPM：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂-Mg)。（4）攪打膠原蛋白 (CS10) 和復(fù)合生物墨水 (CS73) 的體外細(xì)胞活性

（4）體外成骨評價

在氧化應(yīng)激條件下，BMSCs的成骨分化能力受到顯著抑制。ALP染色結(jié)果顯示，HG組的ALP活性明顯減弱，提示早期成骨分化能力下降；相比之下，HGC、HGCP和HGCPM組均呈現(xiàn)更深的染色強度，其中HGCPM組最為明顯，表明納米復(fù)合水凝膠可有效恢復(fù)ALP水平（圖6A）。進(jìn)一步的ARS染色顯示，HG組鈣化結(jié)節(jié)顯著減少，而在HGC、HGCP和HGCPM組中鈣化沉積逐漸增加，且HGCPM組呈現(xiàn)最強的紅色結(jié)節(jié)，提示晚期成骨分化亦得到顯著改善（圖6B）。半定量分析結(jié)果與染色趨勢一致，ALP活性和ARS定量值在納米復(fù)合水凝膠處理組均顯著高于HG組，且以HGCPM組提升幅度最大（圖6C、D）。

分子水平的檢測進(jìn)一步證實了上述結(jié)果。qPCR分析發(fā)現(xiàn)，HG組中ALP、Runx2、Col1a1和Ocn等成骨相關(guān)基因的表達(dá)均明顯下調(diào)，而在HGC、HGCP和HGCPM組中這些基因均被重新激活，并呈現(xiàn)遞增趨勢，其中HGCPM組恢復(fù)程度最顯著（圖6E–L）。免疫熒光染色進(jìn)一步驗證了成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)變化：在HG組中，Runx2、Col1和Ocn等蛋白信號均顯著減弱，而納米復(fù)合水凝膠干預(yù)后熒光信號明顯增強，尤其是HGCPM組幾乎恢復(fù)至正常水平（圖6M–R）。

這些結(jié)果共同說明，氧化應(yīng)激會顯著抑制BMSCs的成骨分化，而納米復(fù)合水凝膠能夠有效緩解這一抑制效應(yīng)，其中GCPM水凝膠的保護(hù)作用最為突出。

圖6 體外成骨能力評估。A) 第14天ALP染色的代表性圖像。B) 第21天ARS染色的代表性圖像。C) 第14天BMSCs的ALP活性。D) ARS染色定量分析鈣沉積。E–H) BMSCs在第3天的成骨相關(guān)基因（Col 1、Runx-2、ALP和OCN）的表達(dá)。I–L) BMSCs在第5天的成骨相關(guān)基因（Col 1、Runx-2、ALP和OCN）的表達(dá)。M–R) BMSCs的Col 1、Runx-2和OCN IF染色的IF強度和代表性圖像的半定量分析。結(jié)果以平均值±SD表示。* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。 S：Sham，HG：H2O2 GelMA，HGC：H₂O₂ GelMA(CeO₂)，HGCP：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂)，HGCPM：H₂O₂ GelMA(PDA@CeO₂-Mg)

圖7 評估生物結(jié)構(gòu)中的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌肉生成。 體外免疫調(diào)節(jié)能力評估。A–C) RAW264.7 M1 極化和促炎細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)的相對標(biāo)志物（iNOS、TNF-α 和 IL-6）。D,E) RAW264.7 M2 極化和抗炎細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)的相對標(biāo)志物（CD206 和 IL-10）（n = 5）。F–H) 使用 ELISA 試劑盒檢測 RAW264.7 中 TNF-α、IL-6 和 IL-10 的代表性細(xì)胞因子分泌情況。I,J) RAW246.7 M1 和 M2 極化標(biāo)志物的代表性 IF 染色圖像

（6）體外血管生成評估

體外血管生成實驗顯示，GCPM組HUVECs遷移能力最強。劃痕實驗結(jié)果表明，GCPM組傷口閉合率顯著高于其他組（圖8A、B）；Transwell遷移實驗結(jié)果也顯示GCPM組遷移細(xì)胞數(shù)量最多（圖8C、D）。毛細(xì)血管形成實驗顯示，GCPM組HUVECs形成的管狀網(wǎng)絡(luò)更完整，管狀節(jié)點數(shù)量顯著高于其他組（圖8E、F），表明GCPM水凝膠具有顯著的促血管生成能力。qPCR檢測顯示，GCPM組在培養(yǎng)1天和3天后HIF-1α、VEGF及VEGFR2基因表達(dá)顯著高于其他組（圖8G–L）。免疫熒光檢測進(jìn)一步顯示，GCPM組VEGFR2和HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增強（圖8M–P），與qPCR結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，GCPM水凝膠在體外具有良好的促血管生成活性，該作用可能與水凝膠中釋放的Mg²⁺有關(guān)。

圖8 體外血管生成能力評估。A) 血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實驗圖像。B) 劃痕實驗定量分析。C) Transwell 小室實驗代表性圖像。D) Transwell 小室實驗定量分析。E) 管腔形成實驗代表性圖像。F) 管腔形成結(jié)構(gòu)定量分析。G–I) 培養(yǎng)第1天HUVECs血管生成相關(guān)基因（VEGF R2、VEGF和HIF-1α）的表達(dá)情況。J–L) 培養(yǎng)第3天HUVECs血管生成相關(guān)基因（VEGF R2、VEGF和HIF-1α）的表達(dá)情況。M–P) HUVECs VEGF R2和HIF-1α IF染色的熒光強度半定量分析及代表性圖像

（7）體內(nèi)新骨形成評估

建立了C57BL/6小鼠雙側(cè)卵巢切除（OVX）骨質(zhì)疏松模型（圖9A）。術(shù)后8周，體重監(jiān)測顯示OVX導(dǎo)致體重下降（圖9B），子宮重量顯著低于假手術(shù)組（圖9C）。Micro-CT分析顯示，OVX組股骨骨密度降低，骨小梁稀疏且間斷（圖9D）；HE染色和TRAP染色進(jìn)一步確認(rèn)骨質(zhì)疏松模型建立成功（圖9E、F）。在骨缺損模型中，GC、GCP和GCPM水凝膠均可促進(jìn)缺損處新骨形成。Micro-CT 3D重建及矢狀面、冠狀面觀察顯示，假手術(shù)組新骨形成較多，而OVX組骨修復(fù)受損；GC、GCP和GCPM組新骨明顯增加，其中GCPM組缺損區(qū)幾乎被新骨完全填充（圖9G）。骨體積分析（BV和BV/TV）顯示，GC、GCP和GCPM水凝膠均顯著促進(jìn)骨再生，GCPM效果最優(yōu)。Micro-CT結(jié)果表明，納米復(fù)合水凝膠在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下可顯著改善骨修復(fù)性能。

圖9 體內(nèi)新骨形成評估。A) 骨質(zhì)疏松癥建模示意圖及納米復(fù)合水凝膠體內(nèi)成骨作用。B) 雙側(cè)卵巢切除術(shù)后小鼠體重變化。C) 雙側(cè)卵巢切除術(shù)后子宮重量。D) 股骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)疏松癥的代表性顯微CT圖像。E) 股骨遠(yuǎn)端H&E染色的代表性圖像。F) 股骨遠(yuǎn)端TRAP染色的代表性圖像。G) 骨缺損周圍再生骨的代表性顯微CT圖像3D重建和切片。H,I) 再生骨組織的BV和BV/TV定量分析

術(shù)后8周，組織學(xué)染色顯示，OVX組顱骨缺損邊緣新骨組織較少，骨修復(fù)能力低；GC、GCP和GCPM組缺損區(qū)新骨明顯增加，其中GCPM組骨礦化幾乎完全填充缺損區(qū)（圖10A）。Masson三色染色顯示，OVX組缺損區(qū)膠原纖維和纖維組織較少，而GC、GCP和GCPM組缺損區(qū)覆蓋大量膠原纖維和新骨組織（圖10B）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，OVX組Col 1和OCN表達(dá)最低，GC、GCP和GCPM組表達(dá)顯著增加，其中GCPM組Col 1和OCN表達(dá)略低于GC和GCP組，可能因骨生成加快使相關(guān)因子趨于正常水平（圖10C、D）。結(jié)果表明，GC、GCP和GCPM水凝膠均能促進(jìn)骨質(zhì)疏松缺損的新骨形成，其中GCPM效果最佳。

圖10 體內(nèi)新骨形成評估。A) 骨缺損區(qū)域H&E染色代表性圖像。B) 骨缺損區(qū)域Masson三色染色代表性圖像。C) Col 1免疫組織化學(xué)染色代表性圖像。D) OCN免疫組織化學(xué)染色代表性圖像。GC：GelMA(CeO₂)，GCP：GelMA(PDA@ CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@ CeO₂-Mg)

此外，CD31 染色結(jié)果表明，與其他組相比，GCPM 組的 CD31 高陽性數(shù)量明顯增多（圖11A）。以上結(jié)果表明，GCPM 水凝膠可通過促進(jìn)成骨和血管生成來顯著增強骨質(zhì)疏松性骨缺損中的骨再生。最后，進(jìn)行毒性評價，以評估納米復(fù)合水凝膠在體內(nèi)的安全性。術(shù)后8周內(nèi)，所有小鼠狀態(tài)良好。H&E染色結(jié)果顯示，各組小鼠均未出現(xiàn)明顯損傷（圖 11B）。這些結(jié)果表明，GC、GCP和GCPM水凝膠均具有良好的體內(nèi)生物相容性。

圖11 體內(nèi)新骨形成評估。A）CD31免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像。B）心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要器官的H&E染色代表性圖像。GC：GelMA(CeO₂)，GCP：GelMA(PDA@CeO₂)，GCPM：GelMA(PDA@CeO₂-Mg)