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針對上述問題，廣西醫(yī)科大學陳文霞、王亞玲和蔣興祿團隊研發(fā)了一種載雙抗生素的抗菌金納米簇（Au NCs）水凝膠（DA@Au NCs），用于再生性牙髓治療。該水凝膠通過靜電相互作用和二硫鍵生成負載藥物，在感染根管間質液作用下可膨脹填滿根管，與細菌充分接觸，并能被間質液和內(nèi)部蛋白酶觸發(fā)降解釋放DA，其交聯(lián)時間可調(diào)節(jié)降解時間。Au NC水凝膠具有放射線顯影能力，可追蹤藥物位置和釋放動態(tài)，提高抗菌效率，實現(xiàn)長期抗菌效果并降低細胞毒性，還能殺滅浮游細菌和生物膜，滲透至牙本質小管。同時，Au NCs的引入有助于支持干細胞的增殖、遷移、黏附和礦化，促進牙髓組織再生。該文章于 2024 年 10 月 9 日以《Visual Antimicrobial Gold Nanocluster Hydrogel with Inflammation-Responsive and Time-Regulated Swelling/Degradation for Regenerative Endodontic Procedures》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c14202）。

圖1. DA@Au NC水凝膠的構建和多功能示意圖

（1）合成與表征 DA@Au NC 水凝膠

通過生物礦化方法，以牛血清白蛋白（BSA）為模板和還原劑，與氯金酸（HAuCl?）在堿性條件下反應合成金納米簇（Au NCs），溶液顏色從淺黃色變?yōu)樯钭厣?，紫外光下熒光呈深紅色。圖 2A 顯示 Au NCs 為 2 ± 0.668 nm 的球形顆粒，圖 2B 顯示其紫外吸收光譜在 275 nm 處有吸收峰。超小 Au NCs 可滲透至牙本質小管，深度約 45 μm（圖 2C）。將水加入 Au NCs 和 DA 的混合物中，通過靜電相互作用和二硫鍵生成制備 DA@Au NC 水凝膠，Au NCs 與水比例小于 1:6 時呈凝膠狀，DA 不影響水觸發(fā)的 Au NC 水凝膠形成（圖 2D）。XPS 結果顯示 Au NC 水凝膠中二硫鍵比例高于 Au NC 溶液（圖 2E、圖 2F），且在二硫蘇糖醇（DTT）溶液中可轉變?yōu)橐后w（圖 2G）。SDS-PAGE 和考馬斯亮藍染色結果表明 DA 能與 Au NCs 表層的 BSA 結合（圖 2I）。SEM 圖像顯示 DA@Au NC 水凝膠孔徑為 7.92 μm（圖 2J），Au NCs 孔徑為 15.23 μm，DA 與 Au NCs 間相互作用影響水凝膠結構。Au NCs 和 DA@Au NCs 的 X 射線強度與 Au NC 濃度呈正相關（圖 2H），可作為根管內(nèi)藥物定位及釋放動態(tài)監(jiān)測的有效示蹤材料。

圖2 DA@Au NC水凝膠的合成與表征。（A）Au NCs的TEM圖像；（B）Au NCs的紫外吸收光譜；（C）Au NCs在牙本質小管中的穿透深度（CLSM）；（D）Au NCs和DA@Au NCs水凝膠的外觀圖像；（E）XPS顯示水凝膠中二硫鍵的增加；（F）溶液中二硫鍵的XPS譜圖；（G）水凝膠在DTT溶液中溶解為溶液（紅色箭頭指向水凝膠）；（H）不同Au NCs濃度下的DA@Au NCs的CT圖像及X射線放射強度隨Au NCs濃度變化的函數(shù)；（I）SDS-PAGE顯示BSA與DA結合的條帶位置；（J）水凝膠的SEM圖像顯示多孔形態(tài)；（K）DA@Au NC水凝膠合成機制及凝膠化機理示意圖

（2）與根管感染控制相關的水凝膠性能

構建的載雙抗生素的金納米簇水凝膠（DA@Au NC hydrogel）可有效控制根管感染。水凝膠能膨脹填充根管，包括根管峽部，延長抗菌劑有效半衰期，且可通過可視化手段監(jiān)測藥物濃度變化。其大孔結構基于 Flory?Rencher 理論，為高膨脹率提供基礎，對藥物有效遞送至根管壁至關重要。細菌感染引起的組織液增加可作為膨脹劑，使水凝膠膨脹吸收炎癥滲出液，填充整個根管腔（圖 3A）。這種膨脹特性有助于控制出血，創(chuàng)造支持性微環(huán)境吸收細胞和因子，確保藥物與根管壁上微生物充分接觸，提高殺菌效率。DA@Au NC 水凝膠的交聯(lián)時間與降解時間呈正相關，交聯(lián) 30 分鐘的水凝膠 10 天內(nèi)完全降解，交聯(lián) 24 小時的水凝膠 50 天后可降解（圖 3B），據(jù)此建立的交聯(lián)時間與降解時間的數(shù)學模型方程為 y = 51.13?45*e(?x/9.5)，擬合指數(shù)為 0.99987，可用于精確計算水凝膠的交聯(lián)時間以適應不同治療需求。水和酶均能觸發(fā)水凝膠降解，且酶催化下降解速率顯著提高，歸因于水凝膠外殼中蛋白質與酶的特異性酶?底物磷酸化反應（圖 3D）。DA@Au NC 水凝膠的間質液 / 酶雙響應特性可根據(jù)炎癥程度精確控制藥物釋放，實現(xiàn)高效、精準的根管內(nèi)感染控制。動物實驗證實了 DA@Au NC 水凝膠在體內(nèi)的 X 射線追蹤性能，為根管內(nèi)藥物的定位和釋放動態(tài)監(jiān)測提供有效手段（圖 3E），且 DA@Au NC 水凝膠不會導致冠部染色，克服了傳統(tǒng)三聯(lián)抗生素中鹽酸米諾環(huán)素引起的冠部變色問題（圖 3I）。

圖3 DA@Au NC水凝膠的控釋特性。（A）DA@Au NC水凝膠的溶脹性能；（B）CLSM和立體顯微鏡顯示水凝膠溶解后填充根管；（C）不同交聯(lián)時間水凝膠的溶脹曲線顯示交聯(lián)時間越長，完全降解所需時間越長；（D）SEM顯示交聯(lián)24小時的水凝膠比交聯(lián)30分鐘的水凝膠更致密、孔隙更少；（E）XPS顯示交聯(lián)時間增加二硫鍵含量增加；（F）酶能加速水凝膠降解；（G）不同交聯(lián)時間水凝膠在體內(nèi)的降解過程；（H）CT圖像顯示根管內(nèi)水凝膠的放射強度和體積變化；（I）功能關系顯示放射強度、體積與剩余藥物量之間的關系；（J）7天后水凝膠未引起牙本質染色

（3）DA@Au NC 水凝膠的抗菌活性

DA@Au NC水凝膠對根管感染相關細菌（包括屎腸球菌和牙齦卟啉單胞菌）的抗菌活性進行了評估，其對這兩種細菌的最小抑制濃度均為4μg/mL，與DA的MIC相同，表明Au NCs的加入不影響DA的抗菌活性。含環(huán)丙沙星的水凝膠能幾乎完全殺死屎腸球菌，而Au NCs和甲硝唑能顯著消除大量牙齦卟啉單胞菌。抑制圈實驗顯示DA@Au NCs的抗菌效果可持續(xù)7天（圖4A），第3天抑制圈減小是因為環(huán)丙沙星釋放速率降低。SEM和TEM觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Au NCs處理的牙齦卟啉單胞菌細胞壁完整性遭到破壞，出現(xiàn)細菌收縮、碎片化和細胞壁降解等現(xiàn)象（圖4B、C），而屎腸球菌未發(fā)現(xiàn)結構損傷。此外，DA@Au NC水凝膠在屎腸球菌生物膜中殺死了85%的細菌，在牙齦卟啉單胞菌生物膜中殺死了87%至92%的細菌（圖4D），顯示出與DA相當?shù)目咕钚?，并且DA能從Au NC水凝膠中充分釋放以殺死細菌。最后，DA@Au NC水凝膠在感染牙本質小管模型中對屎腸球菌和牙齦卟啉單胞菌的殺菌率均達79%（圖4E），表明其能有效穿透牙本質小管殺死細菌，并展現(xiàn)出優(yōu)異的生物膜抗菌活性。

圖4 DA@Au NC水凝膠對E. faecalis和P. gingivalis的抗菌活性。（A）不同藥物處理后不同時間點的抑制圈圖像；（B）經(jīng)Au NCs處理的P. gingivalis的形態(tài)變化和結構損傷的SEM觀察；（C）經(jīng)Au NCs處理的P. gingivalis的TEM觀察（紅色框放大為白色框）；（D）3D生物膜模型和受感染牙本質樣本重建，并通過CLSM分析SYTO9/PI活/死熒光染色圖像；（E）DA@Au NC水凝膠對E. faecalis和P. gingivalis的抗菌活性評估

（4）DA@Au NC 水凝膠的生物相容性及對 DPSC 功能的影響

Au NC水凝膠顯著促進牙髓干細胞（DPSCs）礦化活性。DPSCs在Au NCs誘導下，成骨相關基因（如VEGF和ALPL）表達較高。RNA測序分析顯示，Au NCs礦化能力主要通過調(diào)控細胞趨化、生長因子活性、血管生成和鈣離子轉運等生物過程實現(xiàn)。免疫熒光染色顯示Au NC組中堿性磷酸酶（ALP）表達最高（圖6E）。ALP染色表明，1250μg/mL濃度下Au NCs礦化能力最顯著（圖6F）。RT-PCR結果顯示，Au NCs中礦化相關基因（Runx-2、ALP、COL-I）的mRNA表達量高于對照組（圖6G）。細胞wound scratch實驗顯示，Au NCs和DA@Au NCs的遷移率分別為22%和17%，顯著高于DA組的2%（圖5C）。Au NC水凝膠處理的牙本質切片上，DPSCs顯示出良好細胞伸展特性和微絲連接，而DA處理組細胞數(shù)量顯著減少（圖5B）。這些結果表明，Au NC水凝膠通過調(diào)控ALP表達和相關基因表達，顯著提高DPSCs礦化能力，為細胞遷移和黏附提供有利微環(huán)境，促進牙髓組織再生。

圖5 DA@Au NC水凝膠對DPSCs的生物相容性和功能影響。（A）經(jīng)每種藥物處理的DPSCs的活/死染色；（B）DPSCs在經(jīng)不同處理的牙本質上的黏附和伸展的CLSM圖像（藍色為細胞核，紅色為細胞骨架）；（C）不同組處理后DPSCs遷移的代表性圖像及遷移率；（D）用ALP和ARS染色評估DPSCs礦化能力

圖6 DPSCs在Au NCs培養(yǎng)下的RNA測序分析。（A）火山圖顯示Au NCs與P-Control組間差異表達基因；（B）GO條款和KEGG通路從差異表達基因中富集；（C）差異表達基因的KEGG通路富集分析；（D）代表性差異基因的熱圖；（E）各組ALP表達的免疫熒光染色；（F）不同濃度Au NCs的ALP染色；（G）通過RT-PCR檢測與礦化相關的基因表達

（5）體內(nèi)實驗：DA@Au NC 水凝膠的生物相容性與抗菌效果評估

在犬類根尖周病變模型中，DA@Au NC水凝膠展現(xiàn)出優(yōu)異的X射線追蹤性能，可通過放射強度變化監(jiān)測藥物釋放（圖7B）。經(jīng)過4周治療，DA@Au NC水凝膠顯著減少了根管內(nèi)的細菌數(shù)量（圖7C），并通過CBCT三維重建顯示其促進了根尖周炎癥病變的愈合，療效優(yōu)于其他組（圖7D和表S2）。此外，DA@Au NC水凝膠降低了炎癥相關基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達（圖8A），并通過組織學檢查顯示其促進了根尖周圍組織的修復和新骨形成（圖8B）。免疫熒光染色進一步證實了其降低IL-6表達并提高ALP表達的能力（圖8C）。這些結果表明，DA@Au NC水凝膠具有出色的愈合和修復能力。

圖7 DA@Au NC水凝膠的體內(nèi)生物相容性和抗菌效果評估。（A）根尖周病變模型的建立和根管消毒程序；（B）給藥前后X射線圖像顯示DA@Au NCs水凝膠的放射強度和體積變化；（C）放置根管藥物前后根管內(nèi)細菌菌落計數(shù)；（D）CBCT掃描的3D重建顯示根尖周病變在放置根管藥物前后的變化

圖8 DA@Au NC水凝膠對根尖周病變愈合的影響。（A）通過RT-PCR檢測炎癥相關基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達，DA@Au NC組表達量顯著降低；（B）H&E染色和馬松三色染色顯示DA@Au NC處理后根尖周組織破壞面積減小，該組在根尖區(qū)周圍有大量致密纖維組織和少量新骨形成；（C）免疫熒光染色顯示DA@Au NC組IL-6表達較低，ALP表達較高