哈佛大學醫(yī)學院Howard L. Weiner教授團隊受粘膜免疫系統(tǒng)啟發(fā)，研究了鼻內給藥抗CD3單克隆抗體（aCD3 mAb）治療TBI。研究發(fā)現(xiàn)，該方法可誘導產(chǎn)生IL-10的調節(jié)性T細胞（Treg），這些細胞遷移到大腦與小膠質細胞接觸，通過IL-10依賴機制減輕小膠質細胞的慢性炎癥并調節(jié)其吞噬功能。阻斷IL-10受體會消除aCD3 mAb的益處，而將IL-10產(chǎn)生型Treg細胞移植到TBI小鼠中可恢復這些效果，表明鼻內給藥aCD3 mAb是治療TBI的潛在新策略。該文章于2025年02月27日以《Nasal anti-CD3 monoclonal antibody ameliorates traumatic brain injury, enhances microglial phagocytosis and reduces neuroinflammation via IL-10-dependent crosstalk》為題發(fā)表于《Nature Neuroscience》（DOI：10.1038/s41593-025-01877-7）。

（1）經(jīng)鼻 aCD3 mAb 改善 TBI 后的認知和運動結局

研究采用CCI模型評估鼻內給藥抗CD3單克隆抗體（aCD3）對TBI的治療效果。實驗分為傷后4 - 6小時立即給藥、傷后3天早期給藥和傷后14天延遲給藥，持續(xù)治療1個月。結果顯示，立即給藥組在運動功能和協(xié)調性、空間記憶方面顯著改善，焦慮行為減少；早期給藥組運動功能和協(xié)調性、空間記憶改善，但焦慮行為未改善；延遲給藥組未見改善。在更嚴重的TBI模型中，雄性、雌性小鼠aCD3治療均改善運動功能和協(xié)調性，部分恢復空間記憶。雄性小鼠嚴重TBI后焦慮行為減少，而雌性小鼠無焦慮表型，無法評估aCD3對焦慮行為的益處。結果表明，鼻內給藥aCD3可改善中度和重度TBI的行為學結果，且對雄性小鼠效果更顯著。

圖1 鼻內給藥aCD3治療方案及行為學測試結果。（a）治療方案示意圖；（b）立即治療組行為學測試結果（轉棒實驗、水迷宮實驗、探試實驗、曠場實驗評估焦慮行為），采用兩因素重復測量方差分析（MWM測試）和單因素方差分析（其他測試），數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示；（c）傷后7天MRI腦損傷體積測量，采用雙側非配對t檢驗分析，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，紅色虛線指示損傷區(qū)域；（d）傷后30天H&E染色腦切片損傷體積測量，采用雙側非配對t檢驗分析，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，比例尺1000 μm；（e）傷后7天神經(jīng)元死亡免疫熒光染色（DAPI藍、TUNEL紅、7-AAD綠），比例尺200 μm（放大圖500 μm），TUNEL陽性細胞通過ImageJ定量，采用雙側非配對t檢驗分析，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示；（f）傷后30天小膠質細胞Iba-1免疫熒光染色（DAPI藍、Iba-1紅），比例尺200 μm（放大圖500 μm），Iba-1陽性細胞通過ImageJ定量，采用單因素方差分析分析，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示；（g）傷后1天血清生物標志物檢測，采用Quanterix SiMoA和V-Plex炎癥因子檢測，采用單因素方差分析分析，數(shù)據(jù)以箱線圖（最小值、最大值、四分位距、中位數(shù)）表示。所有數(shù)據(jù)均為兩個獨立實驗的生物學重復

（2）CD3單克隆抗體鼻內給藥改善TBI神經(jīng)病理過程

研究通過多種方法評估了鼻內給藥aCD3對TBI引發(fā)的神經(jīng)病理學結果的影響。傷后7天，3T MRI測量顯示鼻內給藥aCD3組腦實質損傷體積較TBI - iso對照組減少。傷后1個月，H&E染色測量的損傷體積也顯示aCD3治療組較TBI - iso對照組減少。鼻內給藥aCD3在傷后3天改善了血腦屏障（BBB）完整性，降低了TBI - iso對照組同側半球的腦水腫百分比。TUNEL染色檢測到的細胞死亡在鼻內給藥aCD3治療后減少。傷后30天，CCI增加了小膠質細胞或巨噬細胞的激活（Iba - 1染色），而鼻內給藥aCD3在雄鼠中減少了這種激活。與對照組相比，鼻內給藥aCD3組的幾種TBI血清生物標志物減少，而抗炎細胞因子IL - 10增加。這些結果表明，鼻內給藥aCD3改善了TBI小鼠的行為學表現(xiàn)，與神經(jīng)病理學和血清生物標志物所顯示的增強的組織完整性相關。

（3）aCD3單克隆抗體鼻內給藥增加TBI后Treg細胞數(shù)量，改變先天性和適應性免疫格局

研究通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，鼻內給藥aCD3在傷后1天增加頸淋巴結（cLNs）中總CD4+ T細胞和CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞（Treg）的比例，傷后2天增加腦膜中這些細胞的總數(shù)。鼻內給藥aCD3在傷后3天和7天增加大腦中CD4+ T細胞的總數(shù)，并在傷后30天內增加CD4+FoxP3+ Treg細胞。與TBI - iso組相比，未觀察到表達潛伏相關肽（LAP）的CD4+ T細胞增加。結果表明，鼻內給藥aCD3通過擴大Treg細胞來控制TBI后的神經(jīng)炎癥。

（4）aCD3單克隆抗體鼻內給藥誘導的Treg細胞有獨特的免疫調節(jié)特征

鼻內給藥aCD3在傷后30天內增加了CD4+FoxP3+調節(jié)性T細胞（Treg）。對CCI后7天從假手術和受傷小鼠的腦周損傷組織和血液中分離的CD4+FoxP3(GFP)+ Treg細胞進行RNA測序分析。主成分分析（PCA）顯示，TBI后腦內FoxP3 Treg細胞的轉錄組特征與血液中的顯著不同。與假手術小鼠的血液Treg細胞相比，TBI小鼠腦內浸潤的Treg細胞中多種免疫調節(jié)和營養(yǎng)因子基因表達增加。鼻內給藥aCD3處理的小鼠血液中的FoxP3 Treg細胞具有獨特的轉錄組特征，涉及Treg細胞增殖和穩(wěn)態(tài)以及Treg細胞功能的基因上調。通路分析（IPA）顯示，與TBI - iso FoxP3 Treg細胞相比，aCD3誘導的FoxP3 Treg細胞中IL - 10是最主要的上游激活調節(jié)因子。進一步分析發(fā)現(xiàn)，TBI和鼻內給藥aCD3處理的小鼠腦內浸潤的Treg細胞中，免疫調節(jié)相關基因表達上調。此外，aCD3誘導的Treg細胞中，免疫調節(jié)、吞噬調節(jié)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、脂質穩(wěn)態(tài)以及其他Treg細胞免疫抑制功能所需基因的表達進一步增加。基因集富集分析（GSEA）和通路分析（IPA）顯示，與假手術對照組和TBI - iso組相比，TBI - aCD3處理的小鼠腦內Treg細胞中涉及遷移、免疫反應調節(jié)、吞噬、神經(jīng)發(fā)生、穩(wěn)態(tài)和分泌功能的生物通路富集。通路分析（IPA）識別出IL - 10和Stat3是TBI小鼠腦內aCD3處理的Treg細胞中最主要的上游激活調節(jié)因子。流式細胞術分析顯示，與TBI - iso對照組相比，aCD3處理的小鼠腦內Treg細胞中IL - 10表達上調。這些結果表明，外周和中樞Treg細胞具有獨特的免疫調節(jié)特征，與鼻內給藥aCD3治療TBI后的改善相關。

（5）aCD3單克隆抗體鼻內給藥調節(jié)小膠質細胞炎癥反應

鼻內給藥aCD3增加了FoxP3+調節(jié)性T細胞（Treg）向腦膜和CCI損傷部位的遷移，這些細胞在損傷后與小膠質細胞樹突密切接觸。小膠質細胞單細胞懸浮液的RNA測序分析顯示，在傷后7天，TBI - iso和TBI - aCD3組的小膠質細胞轉錄組特征相似，但到傷后30天，TBI - aCD3組的小膠質細胞轉錄組特征向假手術對照組表型轉變，表現(xiàn)為下調促炎基因（如Il6、Il18）和上調穩(wěn)態(tài)基因（如Tgfbr2、Mertk）。在傷后7天，鼻內給藥aCD3處理的小膠質細胞中，穩(wěn)態(tài)和感知相關基因（如Cd33、Lag3）表達增加，且下調促炎關鍵調節(jié)因子Cd14。傷后30天，aCD3處理增加了TGF - β信號通路基因表達（如Smad3、Tgfbr1），并下調了細胞因子受體和模式識別受體相關基因（如Tnfrsf17、Cd74）。基因集富集分析（GSEA）表明，在傷后7天，TBI - iso組上調氧化應激和神經(jīng)元凋亡相關通路，而TBI - aCD3組在這些通路中的基因上調較少，且在抗炎IL - 10產(chǎn)生和吞噬相關通路中基因上調更多。傷后30天，TBI - iso組在促炎機制和細胞殺傷通路中基因表達富集，而TBI - aCD3組在這些通路中的基因上調較少，且在吞噬和細胞因子產(chǎn)生相關通路中基因上調更多。分析傷后30天的炎癥反應基因和疾病相關小膠質細胞（DAMs）、神經(jīng)退行性小膠質細胞（MGnDs）特征基因發(fā)現(xiàn)，TBI - iso小膠質細胞具有促炎反應和DAM或MGnD特征，而aCD3處理的小鼠中這些基因表達下調，接近假手術組水平。定量PCR（RT - qPCR）顯示，鼻內給藥aCD3在傷后7天增加小膠質細胞和腦組織中抗炎細胞因子Il10的表達，并在傷后30天減少促炎標志物表達，同時上調腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Bdnf）。這些結果表明，鼻內給藥aCD3使小膠質細胞從病理性的、疾病相關表型轉變?yōu)橛幸娴?、穩(wěn)態(tài)表型。

（6）鼻腔 aCD3 以 IL-10 依賴性方式增加小膠質細胞吞噬作用

TBI - aCD3處理的小鼠在傷后7天吞噬相關生物學通路顯著上調，且在傷后30天多種關鍵小膠質細胞吞噬調節(jié)因子（Mertk、Sirpa和Tlr4）表達增加。實驗在傷后6天和7天分別注射標記的凋亡神經(jīng)元或PBS，并在注射后16小時和4小時檢測，結果顯示aCD3處理的小鼠在注射后4小時和16小時的吞噬能力均高于TBI - iso組。對傷后7天的吞噬性和非吞噬性小膠質細胞進行RNA測序分析，結果顯示吞噬性TBI - aCD3小膠質細胞在注射后4小時表現(xiàn)出獨特的轉錄組特征，涉及多種關鍵吞噬基因的上調。與非吞噬性TBI - iso小膠質細胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質細胞在識別和吞噬凋亡細胞及碎片（Mertk、Mrc1、Abca1、Lrp1和Stab1）、消化降解吞噬物（Rab27a、Smcr8、Clec16a和Vps8）、脂質代謝（Apoc1、Olr1和Ldlr）、細胞骨架動態(tài)（Myo1e）和調節(jié)小膠質細胞吞噬（Tspo、Qk和Pik3cg）的基因表達增加。基因集富集分析（GSEA）顯示，與非吞噬性TBI - iso小膠質細胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質細胞在吞噬相關通路（包括內吞、模式識別和細胞遷移）中顯著富集。此外，與吞噬性TBI - iso小膠質細胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質細胞在抗原呈遞和IL - 10通路的上調更為顯著。通路分析（IPA）顯示，IL - 10是aCD3處理的吞噬性小膠質細胞中最重要的調節(jié)因子和信號通路。在傷后16小時，也觀察到類似的吞噬機制相關基因和通路的上調，且吞噬性TBI - aCD3小膠質細胞表現(xiàn)出更穩(wěn)態(tài)、更少炎癥（疾病相關）的特征。使用IL - 10基因敲除（KO）小鼠重復小膠質細胞吞噬實驗，結果顯示IL - 10 KO小鼠中TBI - aCD3小膠質細胞在注射后4小時的吞噬能力顯著降低，且與野生型（WT）TBI - iso小膠質細胞相比，IL - 10 KO小鼠的TBI - iso小膠質細胞吞噬能力顯著降低。這些結果表明，鼻內給藥aCD3通過IL - 10依賴的方式增強了小膠質細胞的吞噬機制。

圖4 小膠質細胞吞噬功能的表征及鼻內給藥aCD3的影響。（a）傷后7天小膠質細胞吞噬相關基因的熱圖，基因通過DESeq2分析（雙側似然比檢驗，每組n = 4只小鼠）鑒定，F(xiàn)DR校正P < 0.05的基因用星號表示；（b）吞噬功能實驗示意圖；（c）傷后7天損傷部位的免疫熒光染色（凋亡神經(jīng)元藍、P2ry12紅），顯示P2ry12吞噬凋亡神經(jīng)元，比例尺100 μm（放大圖50 μm）；（d）注射標記的凋亡神經(jīng)元后4小時的小膠質細胞吞噬實驗，數(shù)據(jù)以箱線圖表示，每組n = 5只小鼠，采用雙側非配對t檢驗分析；（e）傷后7天及凋亡神經(jīng)元注射后4小時，吞噬性（+P）和非吞噬性（-P）小膠質細胞的差異表達基因（DEGs）聚類熱圖（DESeq2分析，雙側似然比檢驗，每組n = 3 - 4只小鼠，F(xiàn)DR校正P < 0.05）；（f）與小膠質細胞吞噬及相關功能相關的基因在TBI - iso（+P）與TBI - iso（-P）以及TBI - aCD3（+P）與TBI - iso（-P）比較中的log2（倍數(shù)變化）條形圖；（g）基于上述比較的基因集富集分析（GSEA），q值 < 0.05的富集項用星號表示；（h）與吞噬性TBI - iso小膠質細胞相比，吞噬性TBI - aCD3小膠質細胞的DEGs的通路分析中選擇的頂級典型通路；（i）TBI - aCD3（+P）與TBI - iso（-P）比較中預測的上游調節(jié)因子；（j）與（b）相似設計的吞噬實驗，數(shù)據(jù)以箱線圖表示，每組n = 5只小鼠，采用單因素方差分析分析。所有數(shù)據(jù)均為生物學重復，代表兩個獨立實驗

（7）鼻腔 aCD3 通過小膠質細胞中的 IL-10/IL-10R 信號轉導改善 TBI 預后

在傷后7天，TBI - aCD3組小膠質細胞的IL - 10細胞因子基因表達顯著上調。鼻內給藥aCD3誘導分泌IL - 10的Treg細胞，并在損傷部位的小膠質細胞和腦組織中增加IL - 10表達。通過腹腔注射抗IL - 10R（aIL - 10R）阻斷抗體，每3天一次，研究假手術 - iso、TBI - iso、TBI - aCD3和TBI - aCD3 + aIL - 10R組的行為學結果和血腦屏障（BBB）破壞情況。結果顯示，TBI - aCD3組在BBB破壞以及運動協(xié)調功能、空間記憶和焦慮樣行為方面的改善被IL - 10R阻斷抵消。RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，傷后1個月，鼻內給藥aCD3對小膠質細胞的調節(jié)作用被IL - 10阻斷，小膠質細胞熱圖顯示TBI - aCD3 + aIL - 10R組表現(xiàn)出更促炎的轉錄組特征，且穩(wěn)態(tài)標志物表達減少。使用IL - 10Rflox/floxTmem119CreETR2條件性敲除（KO）小鼠及其同窩對照小鼠，研究小膠質細胞IL - 10R敲除對行為學和小膠質細胞吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)他莫昔芬處理的TBI - aCD3 - IL - 10Rflox/floxTmem119CreETR2小鼠表現(xiàn)出更差的運動和認知結果以及降低的小膠質細胞吞噬能力。這些結果表明，IL - 10/IL - 10R信號在增強小膠質細胞吞噬能力和改善TBI疾病中起關鍵作用。

（8）鼻腔 aCD3 誘導的 CD4⁺FoxP3⁺Treg細胞改善神經(jīng)炎癥和 TBI 結果

鼻內給藥aCD3在傷后3天至30天增加了損傷部位的FoxP3+ Treg細胞，并通過減少小膠質細胞炎癥改善了TBI的行為學和神經(jīng)病理學結果。過繼轉移實驗中，接受aCD3處理小鼠的CD4+FoxP3+ Treg細胞的小鼠在傷后7天表現(xiàn)出改善的運動功能和協(xié)調性，并恢復了空間記憶。對TBI - aCD3 - FoxP3+、TBI - iso - FoxP3+和TBI - aCD3 - FoxP3? GFP組小鼠損傷側半球的小膠質細胞進行RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質細胞與其他組相比具有獨特的轉錄組特征?；蚣患治觯℅SEA）顯示，與TBI - aCD3 - FoxP3?小膠質細胞相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質細胞下調了包括干擾素（IFN）γ和IFNα在內的多種促炎通路。通路分析（IPA）揭示IL - 10Ra是TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質細胞中最重要的上游激活調節(jié)因子之一，而IL - 1b是最重要的上游抑制調節(jié)因子之一。與TBI - iso - FoxP3+小膠質細胞相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質細胞中IFNγ是最顯著下調的調節(jié)因子之一。定量PCR（RT - qPCR）顯示，與另外兩組相比，TBI - aCD3 - FoxP3+小膠質細胞中促炎細胞因子減少，穩(wěn)態(tài)和抗炎細胞因子表達增加。接受aCD3處理小鼠的CD4+FoxP3+ Treg細胞的小鼠在傷后7天增加了小膠質細胞的吞噬能力。這些結果表明，F(xiàn)oxP3+ Treg細胞在增強小膠質細胞吞噬能力和改善TBI疾病中起關鍵作用。

圖6 Treg細胞對TBI后行為學和小膠質細胞炎癥的影響。（a）過繼轉移實驗時間線；（b）轉棒實驗和Y迷宮測試結果，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析分析；（c）傷后7天小膠質細胞的差異表達基因（DEGs）聚類熱圖，基因通過DESeq2分析（雙側Wald檢驗，每組n = 3只小鼠，F(xiàn)DR校正P < 0.05）鑒定，聚類用基因本體生物學過程（GOBP）富集項（q值 < 0.05）注釋；（d）基因集富集分析（GSEA）分析TBI - iso FoxP3與TBI - aCD3 - FoxP3?以及TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - aCD3 - FoxP3?的比較，q值 < 0.05的富集項用星號表示；（e）TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - aCD3 - FoxP3?比較的預測上游調節(jié)因子（通路分析）；（f）TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - iso FoxP3比較的基因集富集分析；（g）TBI - aCD3 - FoxP3與TBI - iso FoxP3比較的預測上游調節(jié)因子（通路分析）；（h）傷后7天損傷側半球小膠質細胞的定量PCR分析，以GAPDH為內參，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析分析；（i）與圖4b相似設計的小膠質細胞吞噬實驗，數(shù)據(jù)以箱線圖（最小值、最大值、四分位距、中位數(shù)）表示，采用單因素方差分析分析；（j）小膠質細胞和Treg細胞共培養(yǎng)示意圖；（k）小膠質細胞的定量PCR分析，以GAPDH為內參，數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析分析。所有數(shù)據(jù)均為生物學重復，代表兩個獨立實驗

（9）CD4⁺Foxp3⁺Treg細胞在體外抑制小膠質細胞炎癥和穩(wěn)態(tài)標志物

采用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)，從小鼠CCI損傷后24小時的損傷側半球分離小膠質細胞，并從接受CCI和鼻內給藥aCD3或同型對照處理7天的小鼠脾臟中分離Treg細胞。共培養(yǎng)72小時后對小膠質細胞進行定量PCR分析，結果顯示，與TBI - iso組相比，TBI - aCD3組小膠質細胞中抗炎和穩(wěn)態(tài)標志物（Il10、Cx3cr1和Cd206）增加，促炎標志物Il1b減少，這與傷后7天的體內小膠質細胞轉錄組數(shù)據(jù)一致。此外，通過體外阻斷IL - 10，這種效應消失，這也與體內IL - 10中和后的觀察結果一致。

（10）產(chǎn)生IL-10的Treg細胞促進小膠質細胞吞噬、改善神經(jīng)炎癥及功能預后

鼻內給藥aCD3處理小鼠的FoxP3 Treg細胞過繼轉移可改善TBI，且IL - 10在其中發(fā)揮重要作用。利用FoxP3 - DTR轉基因小鼠耗竭FoxP3 Treg細胞，白喉毒素（DT）在CCI前3天注射，并每3天重復一次，直至CCI或假手術后7天。結果表明，F(xiàn)oxP3 Treg細胞的耗竭惡化了運動功能，加劇了小膠質細胞炎癥，并增加了促炎小膠質細胞標志物（Il1b、Tnf、Il6和Il18）的表達。FoxP3 Treg細胞的耗竭降低了小膠質細胞吞噬死亡神經(jīng)元的能力。使用10BiT.FoxP3GFP雙重報告系統(tǒng)分離IL - 10+和IL - 10? Treg細胞，并將這些細胞過繼轉移至FoxP3耗竭小鼠中，觀察到IL - 10+ Treg細胞與IL - 10? Treg細胞相比，改善了運動功能和空間記憶，降低了促炎標志物的表達，并且增強了小膠質細胞對死亡神經(jīng)元的吞噬能力。因此，IL - 10在鼻內給藥aCD3誘導的FoxP3 Treg細胞對TBI的有益效果中起關鍵作用。