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針對上述問題，南昌大學萬文兵團隊受天然骨“致密-多孔”分層結(jié)構(gòu)啟發(fā)，構(gòu)建了礦化脫細胞蓮莖（MDL）與負載碳酸錳的介孔聚多巴胺微球（MM@MDL3）復合支架。該支架可持續(xù)釋放CO和Mn2?，協(xié)同促進M2巨噬細胞極化、抑制炎癥，并通過BMP-2/SMAD/RUNX-2通路顯著誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化。大鼠顱骨缺損實驗證實，MM@MDL3可顯著增加新生骨體積、促進血管長入并減少破骨細胞生成，展現(xiàn)出修復大段骨缺損的臨床轉(zhuǎn)化潛力。該文章于2025年7月2日以《Bioinspired Immunomodulatory Scaffold Based on Mineralized Lotus Stalks Laden with MnCO Microspheres for Accelerated Bone Regeneration》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202502919）。

（1）空心介孔聚多巴胺藥物遞送系統(tǒng)的制備與表征

MnCO@mPDA顆粒成功構(gòu)建：SEM（圖1B）示mPDA多孔結(jié)構(gòu)被填充；TEM與EDX（圖1E）證實C、O、N外新增Mn；粒徑由mPDA的255 nm增至295 nm（圖1C），Zeta電位由?0.39 mV降至?22.17 mV（圖1D）。FTIR在2000 cm?1出現(xiàn)碳酸錳峰（圖1F），XPS于641.4 eV處檢出Mn峰（圖1G）。CO釋放動力學（圖1H）：隨時間延長，血紅蛋白430 nm吸收下降，碳氧血紅蛋白410 nm吸收上升。細胞相容性（圖1I）：rBMSCs在0–50 μg mL?1存活率>90%，50 μg mL?1為最佳工作濃度；12.5–50 μg mL?1連續(xù)5天無毒性，100 μg mL?1第3天起出現(xiàn)顯著毒性。

圖1.多聚多巴胺藥物遞送系統(tǒng)的制備和表征。（A） 空心介孔聚多巴胺微球制備過程的示意圖。（B） SEM/EDX 圖像顯示了具有和沒有羰基錳負載的介孔多巴胺微球的形態(tài)，以及相應的元素組成分析。（C） 介孔聚多巴胺微球的尺寸分布曲線。（D） 錳羰基負載前后介孔聚多巴胺微球的 Zeta 電位測量。（E） 元素分布圖 （TEM），顯示負載的介孔聚多巴胺微球內(nèi)錳的分布。（F） 聚多巴胺、羰基錳和負載羰基錳的介孔多巴胺微球 （MnCO@mPDA） 的 FTIR 光譜。（G） MnCO@mPDA 的 XPS 分析。（H） 紫外-可見吸收檢測 CO 釋放。（I） 與不同濃度 MnCO@mPDA 共培養(yǎng) 1、3 和 5 天的 BMSCs 的細胞相容性測定。p < 0.001

（2）復合脫細胞蓮花莖支架的制備與表征

圖2A示復合脫細胞蓮莖支架制備示意；圖2B為Lotus、DL、MDL、MDL-3、MM@MDL-3實物；圖2C、2D顯示DL已去除>95% DNA與蛋白；圖2E給出DL孔隙率88.66±1.76%，礦化后降至67.33±0.88%；圖2F測得大孔徑2000 μm、小孔徑130 μm；圖2G–H證實所有支架具大孔及小管結(jié)構(gòu)；圖2I示縱向定向垂直通道；圖2J–M示DL壓應力0.49±0.02 MPa、拉應力0.20±0.05 MPa，礦化后分別升至8.54±0.36 MPa與1.24±0.03 MPa，三次凍融后分別增至12.04±0.48 MPa與1.41±0.02 MPa，MnCO@mPDA的加入使應力略再提高。

圖2 功能化蓮花葉柄的表征。（A）制備流程示意圖；（B）各階段實物照片；（C,D）DL脫細胞后DNA與蛋白殘留量；（E,F）孔隙率及孔徑；（G,H）橫截面與縱向多孔通道形貌；（I）通道取向分析；（J–M）壓縮與拉伸力學性能

（3）復合脫細胞蓮莖支架干細胞招募實驗和體外成骨實驗

圖3A示MM@MDL3支架內(nèi)BMSCs沿縱向通道遷移，第1天聚集0–100 μm，第3天達200–400 μm，第7天深入500 μm，各深度細胞密度均高于DL、MDL、MDL3。圖3B顯示所有樣本ALP陽性，MM@MDL3于7 d和14 d染色最深；圖3C、D定量ALP活性與染色一致。圖3E–G示ARS鈣結(jié)節(jié)染色紅色隨培養(yǎng)加深，MM@MDL3礦化最高。RT-qPCR表明，與DL相比，MDL、MDL3、MM@MDL3在各時間點Runx2、Col I、OPN表達均上調(diào)，以MM@MDL3增幅最大。

圖3 MM@MDL3對BMSC遷移與成骨分化的影響。（A）共培養(yǎng)1、3、7 D后BMSC垂直遷移的3D重建；（B）7 D與14 D的ALP染色；（C,D）對應ALP活性定量；（E）7 D與14 D的ARS染色；（F,G）鈣結(jié)節(jié)定量

（4）復合脫細胞蓮莖支架的體內(nèi)成骨評價

圖4A示術后4、8周Micro-CT重建及矢狀面影像，MDL、MDL3、MM@MDL3組新骨覆蓋率高于對照與DL；圖4B–D量化顯示MM@MDL3的BV/TV最高、Tb.Th最大、Tb.Sp最小。圖S9A的HE染色及定量表明MM@MDL3有機骨基質(zhì)最多；圖4E的三色染色與定量證實其膠原基質(zhì)亦最高。圖4F的CD31免疫熒光顯示MM@MDL3血管新生最顯著。

圖4 MM@MDL3對骨再生的影響。（A）術后1、2月Micro-CT重建及橫截面影像；（B）BV/TV定量；（C）Tb.Sp；（D）Tb.Th；（E）Masson三色染色示膠原沉積；（F）CD31免疫組化示血管新生

（5）復合脫細胞蓮莖支架的定向骨生長能力

如圖5A所示，該示意圖說明了功能化蓮花莖用于頜骨缺陷修復的植入過程。紅色箭頭指示細胞遷移的方向。在對骨缺陷模型脫鈣股骨的三色染色圖像進行定向分析中，對照組顯示再生骨中的膠原蛋白矩陣取向混亂。相比之下，DL、MDL、MDL 3和MM@MDL 3組表現(xiàn)出膠原蛋白矩陣的有序定向生長，垂直于骨缺陷方向（圖5 B）。

圖5 功能化蓮花葉柄引導定向骨基質(zhì)沉積。（A）長骨缺損修復示意圖，紅色箭頭示細胞遷移方向；（B）術后4周股骨缺損區(qū)三色染色，黑色箭頭示骨基質(zhì)取向；（C）三色染色偽彩圖示再生骨基質(zhì)定向；（D）各組再生基質(zhì)角度分布

（6）復合脫細胞蓮莖支架的抗炎能力

圖6A–C示RAW264.7細胞經(jīng)MM@MDL3提取物處理后CD206↑、NOS↓，提示M2極化；圖6D、E顯示MM@MDL3使ROS熒光最低，自由基清除率61.87±1.63%。圖6F–H示術后4周植入?yún)^(qū)CD206↑、CD86↓，MM@MDL3 M2表達最高；圖6I示其M1/M2比值最低。圖6J–L GO與GOBP分析均顯示MM@MDL3上調(diào)適應性免疫、吞噬及趨化相關通路。

圖6 MM@MDL3對炎癥反應的影響。（A）RAW264.7極化示意；（B,C）CD86與CD206表達；（D,E）L929抗氧化；（F–H）缺損區(qū)M1/M2巨噬細胞；（I）M1/M2比值；（J）GO富集；（K,L）GOBP富集

（7）復合脫細胞蓮莖支架的成骨機制研究

圖7A–D示與對照及DL相比，MDL、MDL3、MM@MDL3組BMP2、SMAD、RUNX2熒光增強，MM@MDL3表達最高；圖7E–J示術后4周MM@MDL3組C-FOS、RANKL下調(diào)，HIF-1β、P85上調(diào)，提示其經(jīng)BMP2/SMAD/RUNX2促成骨，并藉PI3K/Akt/HIF-1β抑破骨。

圖7 MM@MDL3對骨修復相關基因表達的影響。（A）BMP2、SMAD、RUNX2免疫熒光；（B–D）RANKL、CFOS免疫熒光；（E–G）P85、HIF-1Α免疫熒光

圖8A示PCA區(qū)分MM@MDL3與對照；圖8B火山圖列上調(diào)3301、下調(diào)3429基因；圖8C–E GO與GOBP示細胞粘附及成骨通路上調(diào)；圖8F、G示血管生成、礦化、骨重塑增強；圖8H網(wǎng)絡圖確認骨形態(tài)發(fā)生、成骨分化富集；圖8I熱圖列Ctsk、Tnn、Gpnmb、Sphk1上調(diào)。

圖8 MM@MDL3的RNA-SEQ分析。（A）PCA；（B）火山圖；（C）細胞行為GO；（D,E）細胞粘附與骨化GOBP；（F）骨重塑GO；（G）血管生成GO；（H）CYTOSCAPE/CLUEGO網(wǎng)絡；（I）差異基因熱圖