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針對(duì)上述問(wèn)題，華南理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院王均、袁友永團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種生物仿生混合PROTAC脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)（M@TP），該系統(tǒng)能夠穿透血腦屏障并特異性靶向GBM細(xì)胞。進(jìn)入TMZ耐藥性GBM細(xì)胞后，M@TP釋放的PROTAC可特異性降解BRD4，抑制DNA修復(fù)通路，恢復(fù)對(duì)TMZ的敏感性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，M@TP在抑制TMZ耐藥性和術(shù)后GBM腫瘤生長(zhǎng)方面效果顯著，并延長(zhǎng)了小鼠生存時(shí)間，為克服TMZ耐藥性提供了潛在策略。該文章于2025年5月9日以《Biomimetic Hybrid PROTAC Nanovesicles Block Multiple DNA Repair Pathways to Overcome Temozolomide Resistance Against Orthotopic Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202504253）。

研究示意圖

（1）BRD4通過(guò)增強(qiáng)DNA修復(fù)促進(jìn)替莫唑胺耐藥性

研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞中BRD4表達(dá)與替莫唑胺（TMZ）耐藥性密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)TMZ處理的人U251MG和鼠GL261膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中BRD4表達(dá)呈濃度依賴(lài)性增加（圖1a）。在U251MG和GL261膠質(zhì)瘤原位模型中，TMZ處理后組織中BRD4水平顯著升高（圖1c、d）。此外，TMZ耐藥細(xì)胞系中BRD4水平高于敏感細(xì)胞系，且BRD4表達(dá)與TMZ的IC50值呈正相關(guān)（圖1e、f）。全基因組RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞系中DNA修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，GO富集分析顯示與DNA修復(fù)相關(guān)的分子功能顯著富集（圖1g、h、i），GSEA分析也證實(shí)了核酸酶活性調(diào)控通路的上調(diào)（圖1j），表明BRD4可能通過(guò)促進(jìn)DNA修復(fù)通路的激活，導(dǎo)致GBM細(xì)胞對(duì)TMZ耐藥性的發(fā)展。

圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞中BRD4表達(dá)水平與替莫唑胺耐藥性相關(guān)。（a）Western blot分析不同濃度替莫唑胺處理后GBM細(xì)胞中BRD4表達(dá)水平及熱圖分析；（b）U251MG和GL261原位膠質(zhì)瘤小鼠接受口服替莫唑胺治療方案示意圖；（c）和（d）有無(wú)替莫唑胺處理的GBM組織BRD4表達(dá)的免疫熒光圖像（標(biāo)尺：100μm）和Western blot分析；（e）替莫唑胺敏感和耐藥細(xì)胞中BRD4表達(dá)的共聚焦熒光圖像（標(biāo)尺：20μm）；（f）替莫唑胺敏感和耐藥細(xì)胞的IC50值及BRD4熒光強(qiáng)度比較；（g）轉(zhuǎn)錄改變的熱圖；（h）U251MG與U251MG-R細(xì)胞中差異表達(dá)基因的火山圖；（i）與DNA修復(fù)機(jī)制相關(guān)的差異表達(dá)基因的GO富集分析；（j）U251MG與U251MG-R細(xì)胞的GSEA分析

（2）通過(guò)下調(diào)GBM細(xì)胞中的BRD4表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)TMZ耐藥性

研究開(kāi)發(fā)了一種靶向BRD4的PROTAC分子“Pro”，通過(guò)柔性連接臂將BRD4抑制劑JQ1與VHL E3連接酶配體連接。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示Pro可與BRD4和VHL形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，關(guān)鍵殘基通過(guò)氫鍵和疏水作用相互連接，且模擬中BRD4和VHL的RMSD在20納秒后穩(wěn)定（圖2a、b）。蛋白質(zhì)印跡法表明Pro以劑量依賴(lài)性方式降解TMZ敏感和耐藥GBM細(xì)胞中的BRD4，低至50 nM的濃度即可有效降解BRD4，且降解依賴(lài)于JQ1和VHL配體的結(jié)合（圖2c、d）。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Pro可顯著增強(qiáng)TMZ對(duì)耐藥GBM細(xì)胞的細(xì)胞毒性，即使在100:1的低比例下，也能將TMZ的IC50值從1277 μM降低至725.8 μM，并抑制TMZ誘導(dǎo)的BRD4上調(diào)，與TMZ表現(xiàn)出協(xié)同作用（圖2e、f）。這些結(jié)果表明Pro可有效克服TMZ耐藥性，增強(qiáng)其對(duì)耐藥GBM細(xì)胞的療效。

圖2 Pro通過(guò)下調(diào)GBM細(xì)胞中的BRD4表達(dá)逆轉(zhuǎn)TMZ耐藥性。（a）Pro、BRD4和VHL E3連接酶三元復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬，綠色為VHL E3連接酶，紅色為BRD4蛋白；（b）三元復(fù)合物中蛋白質(zhì)RMSD統(tǒng)計(jì)值，突顯最后100 ns的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；（c）Western blot分析不同濃度Pro處理的GBM細(xì)胞（U251MG、U251MG-R、GL261、GL261-R）中BRD4蛋白表達(dá)水平；（d）基于半定量分析的熱圖（n=3），顯示TMZ敏感和耐藥細(xì)胞在不同Pro濃度下的BRD4表達(dá)情況；（e）U251MG-R細(xì)胞經(jīng)TMZ和Pro不同比例處理48小時(shí)后的細(xì)胞毒性；（f）TMZ和Pro不同比例對(duì)U251MG-R細(xì)胞的IC50值和組合指數(shù)（CI）值

（3）M@TP的制備與表征

為解決PROTAC在膠質(zhì)瘤治療中因藥代動(dòng)力學(xué)欠佳和血腦通透性有限的問(wèn)題，Pro通過(guò)二硫鍵與PC偶聯(lián)得到前藥PC-ss-Pro，其在高GSH水平的腫瘤環(huán)境中可特異性恢復(fù)蛋白降解活性。隨后，將TMZ和PC-ss-Pro以50:1比例與脂質(zhì)材料結(jié)合制備成脂質(zhì)體（TP），并進(jìn)一步與U251MG-R細(xì)胞膜共擠壓，制備出具有穿血腦屏障和靶向GBM能力的仿生混合囊泡（M@TP）（圖3a）。高效液相色譜分析顯示，在10 mM GSH中，PC-ss-Pro可有效釋放活性藥物Pro（圖3b）。動(dòng)態(tài)光散射分析表明，細(xì)胞膜摻雜后TP粒徑從160.8 nm增加到173.2 nm（圖3c），表面電荷從?43.6±1.4 mV降低到?40.6±1.1 mV（圖3d）。透射電子顯微鏡圖像顯示M@TP具有典型脂質(zhì)體特征和球形囊泡形態(tài)（圖3e），且在生物相關(guān)溶液中粒徑一周內(nèi)無(wú)明顯變化，表現(xiàn)出優(yōu)異穩(wěn)定性（圖S10）。熒光染料標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞膜與TP成功融合（圖3f、g、h），SDS-PAGE分析顯示M@TP與U251MG-R細(xì)胞膜具有相同蛋白質(zhì)組成（圖3i）。在模擬生理和腫瘤微環(huán)境中，M@TP表現(xiàn)出藥物釋放動(dòng)力學(xué)的pH和氧化還原響應(yīng)性，72小時(shí)后TMZ和Pro的累積釋放率分別為73.3%和78.8%（圖3j、k）。這些結(jié)果證實(shí)了腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性仿生混合PROTAC納米囊泡的成功制備。

圖3 M@TP的制備與表征。（a）M@TP制備的示意圖；（b）Pro、PC和Pro-ss-PC在有無(wú)10 mM GSH處理下的HPLC譜圖；（c）TP、U251MG-R細(xì)胞膜（M）和M@TP的平均直徑；（d）TP、U251MG-R細(xì)胞膜（M）和M@TP的zeta電位；（e）M@TP的TEM圖像（標(biāo)尺：200 nm）；（f）通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）獲得的DiD標(biāo)記的TP（DiD-TP）和DiO標(biāo)記的U251MG-R細(xì)胞膜（DiO-M）的共定位圖像（標(biāo)尺：500 nm）；（g）FRET示意圖；（h）用FRET對(duì)偶染料（DiO和DiD）標(biāo)記的脂質(zhì)體與不同量的U251MG-R細(xì)胞膜融合以評(píng)估融合情況；（i）通過(guò)SDS-PAGE電泳確定的U251MG-R細(xì)胞、M、M@TP和TP的蛋白質(zhì)組成；（j）和（k）M@TP在不同pH值（7.4或5.0）下與或無(wú)10 mM GSH孵育時(shí)釋放的TMZ和Pro的累積釋放

（4）體外抗腫瘤作用

研究發(fā)現(xiàn)，TMZ通過(guò)DNA甲基化造成DNA雙鏈斷裂發(fā)揮抗腫瘤作用，但其效果受多種DNA修復(fù)機(jī)制（如MGMT、Ku80和RAD51）的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT試驗(yàn)評(píng)估了M@TP在U251MG-R細(xì)胞中的毒性（圖4a），結(jié)果顯示M@T和M@P對(duì)細(xì)胞活力抑制較弱，而TP因BRD4耗竭增強(qiáng)TMZ敏感性，表現(xiàn)出更強(qiáng)細(xì)胞毒性；M@TP則顯示出最強(qiáng)的抗腫瘤活性，歸因于細(xì)胞膜修飾增加細(xì)胞攝取。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到TP處理組U251MG-R細(xì)胞凋亡率為21.1%，M@TP處理組凋亡率最高，達(dá)33.2%（圖4b）。γH2A.X作為T(mén)MZ誘導(dǎo)DNA損傷的標(biāo)志物，其水平在TP處理組高于M@T和M@P處理組，而M@TP處理組γH2A.X水平最高，且DNA片段化最明顯（圖4c、d）。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡分析顯示，含PC-ss-Pro的納米顆粒（M@P、TP和M@TP）顯著降低了U251MG-R細(xì)胞中BRD4蛋白水平（圖4e），并降低了TMZ耐藥相關(guān)蛋白（MGMT、Ku80和RAD51）的表達(dá)（圖4f、g），同時(shí)M@TP誘導(dǎo)了最高的γH2A.X水平（圖4g）。這些結(jié)果表明，M@TP通過(guò)降解BRD4，抑制DNA修復(fù)蛋白表達(dá)，增強(qiáng)DNA損傷，重塑U251MG-R細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性。

圖4 M@TP的細(xì)胞毒性及克服TMZ耐藥性的作用機(jī)制。（a）不同配方處理U251MG-R細(xì)胞48小時(shí)后的細(xì)胞毒性；（b）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同配方處理U251MG-R細(xì)胞24小時(shí)后的凋亡分析結(jié)果餅圖；（c）不同配方處理U251MG-R細(xì)胞48小時(shí)后的彗星試驗(yàn)代表性熒光圖像（標(biāo)尺：100 μm）；（d）彗星試驗(yàn)軟件項(xiàng)目（CASP）對(duì)（c）中DNA尾部長(zhǎng)度的定量；（e）不同處理后U251MG-R細(xì)胞內(nèi)BRD4水平的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像（標(biāo)尺：10 μm）；（f）不同處理后U251MG-R細(xì)胞內(nèi)MGMT、Ku80和RAD51水平的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像（標(biāo)尺：5 μm）；（g）不同配方處理U251MG-R細(xì)胞后BRD4、MGMT、Ku80、RAD51、γH2A.X和β-actin蛋白水平的Western blot分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）計(jì)算

（5）M@TP同源靶向特性的體外和體內(nèi)評(píng)價(jià)

研究制備了帶有或不帶有膜修飾的Cy5標(biāo)記脂質(zhì)納米顆粒（M@Cy5 LNP和Cy5 LNP），并評(píng)估了它們?cè)赨251MG-R細(xì)胞中的攝取行為。結(jié)果顯示，M@Cy5 LNP在細(xì)胞質(zhì)中的Cy5強(qiáng)度比Cy5 LNP高2.3倍（圖5a、b）。在不同細(xì)胞類(lèi)型中，M@Cy5 LNP表現(xiàn)出特異性攝取能力。在3D多細(xì)胞腫瘤球體中，M@Cy5 LNP的熒光均勻分布于整個(gè)腫瘤球體，而Cy5 LNP僅限于外圍，表明M@Cy5 LNP具有更強(qiáng)的腫瘤穿透能力（圖5c）。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，M@Cy5 LNP在體外穿過(guò)血腦屏障的能力顯著優(yōu)于Cy5 LNP（圖5d）。此外，M@Cy5 LNP處理后，腦內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd.3）中關(guān)鍵緊密連接蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，表明其可能通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接增強(qiáng)BBB穿透能力。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，M@Cy5 LNP在原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠腦腫瘤部位的熒光信號(hào)強(qiáng)烈，4小時(shí)達(dá)到峰值并持續(xù)至48小時(shí)，而Cy5 LNP和游離Cy5的熒光較弱（圖5e）。體外成像顯示，M@Cy5 LNP治療組的腦部熒光強(qiáng)度顯著高于其他組（圖5f、g）。藥代動(dòng)力學(xué)分析表明，M@TP的全身循環(huán)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，其t1/2為9.61小時(shí)，比游離Pro（1.48小時(shí)）長(zhǎng)六倍多，比TP（4.08小時(shí)）長(zhǎng)兩倍多。M@TP的AUC值也顯著高于游離藥物和TP，表明其顯著增強(qiáng)了TMZ和Pro在血液中的滯留時(shí)間。這些結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞膜包覆的M@TP具有優(yōu)越的血腦屏障穿透能力和同型腫瘤靶向能力，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療提供了有力支持。

圖5 體外和體內(nèi)評(píng)估M@TP的同源靶向特性。（a）通過(guò)CLSM觀察Cy5 LNP和M@Cy5 LNP處理U251MG-R細(xì)胞2小時(shí)后的細(xì)胞攝取情況（標(biāo)尺：20 μm）；（b）流式細(xì)胞術(shù)觀察Cy5 LNP和M@Cy5 LNP處理U251MG-R細(xì)胞2小時(shí)后的細(xì)胞攝取情況；（c）Cy5 LNP和M@Cy5 LNP在U251MG-R多細(xì)胞球體中的穿透能力（標(biāo)尺：100 μm）；（d）使用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估Cy5 LNP和M@Cy5 LNP穿過(guò)血腦屏障的能力，紅色為NPs（Cy5信號(hào)），藍(lán)色為Hoechst 33342標(biāo)記的細(xì)胞核，綠色為Alexa Fluor 488鬼筆石堿標(biāo)記的bEnd.3細(xì)胞骨架F-actin，bEnd.3和U251MG-R圖像的標(biāo)尺為10 μm，血腦屏障層的標(biāo)尺為5 μm；（e）體內(nèi)注射后不同時(shí)間點(diǎn)，U251MG-R原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠體內(nèi)自由Cy5、Cy5 LNP或M@Cy5 LNP的分布情況；（f）體外熒光圖像，展示注射自由Cy5、Cy5 LNP或M@Cy5 LNP 24小時(shí)后U251MG-R原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠主要器官和膠質(zhì)瘤腫瘤的熒光圖像；（g）腦腫瘤切片的代表性熒光圖像，N為正常腦組織，T為腫瘤（標(biāo)尺：100 μm）。統(tǒng)計(jì)顯著性通過(guò)Student's t-test計(jì)算

（6）在U251MG-R原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中克服替莫唑胺耐藥性

研究在攜帶替莫唑胺耐藥性U251MG-R-luc膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的小鼠體內(nèi)評(píng)估了M@TP的抗腫瘤效果。小鼠在腫瘤細(xì)胞注射后第10天被隨機(jī)分為四組，分別靜脈注射PBS、M@T、M@P和M@TP，共五次（每三天一次）（圖6a）。結(jié)果顯示，M@TP治療組顯示出最強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)（圖6b、c），而M@T和M@P治療效果有限。接受M@T和M@TP治療的小鼠體重變化不明顯，而PBS組和M@P組體重顯著下降（圖6d）。生存曲線(xiàn)分析表明，M@TP治療組小鼠的中位生存期為59天，顯著長(zhǎng)于其他組（圖6e）。H&E染色結(jié)果顯示M@TP組腫瘤病灶最?。▓D6f）。免疫熒光染色分析表明，M@TP誘導(dǎo)了Tunel陽(yáng)性凋亡細(xì)胞和γH2A.X陽(yáng)性核損傷，并顯著降低了DNA修復(fù)標(biāo)志物（BRD4、MGMT、Ku80和RAD51）的表達(dá)（圖6g）。重要器官的H&E染色和血液生化檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)明顯病變或異常（圖S20、S21）。這些結(jié)果表明，仿生混合PROTAC納米囊泡M@TP通過(guò)阻斷多種DNA修復(fù)途徑，在耐藥性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中表現(xiàn)出優(yōu)異療效。

圖6 在U251MG-R原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中體內(nèi)克服TMZ耐藥性。（a）U251MG-R-luc腫瘤小鼠抗腫瘤治療的示意圖；（b）U251MG-R-luc腫瘤小鼠在不同時(shí)間的體內(nèi)成像；（c）不同治療后小鼠腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度的定量分析；（d）接受不同治療U251MG-R-luc腫瘤小鼠的體重變化；（e）不同治療后小鼠的Kaplan-Meier生存分析；（f）從每個(gè)組中切取的全腦進(jìn)行H&E染色圖像（標(biāo)尺：1 mm）；（g）每組原位腦腫瘤小鼠模型的Tunel、γH2A.X、BRD4、MGMT、Ku80和RAD51染色圖像（標(biāo)尺：50 μm）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）計(jì)算

（7）TMZ與M@P在術(shù)后惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型中的聯(lián)合治療

為研究BRD4降解劑Pro抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的潛力，GL261-luc膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞被正位接種到C57小鼠體內(nèi)。在腫瘤接種后第16天，通過(guò)手術(shù)顯微鏡切除原發(fā)腫瘤組織，建立術(shù)后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型（圖7a、b）。手術(shù)后，生物發(fā)光信號(hào)顯著降低（圖7d），但H&E染色顯示存在殘留腫瘤灶（圖7c）。隨后，小鼠被分為四組（PBS、游離替莫唑胺、M@P和替莫唑胺+M@P），以評(píng)估抑制復(fù)發(fā)的療效。結(jié)果顯示，與PBS組相比，F(xiàn)ree TMZ或M@P治療僅輕微減少腫瘤復(fù)發(fā)（圖7d、e），而TMZ和M@P的聯(lián)合治療對(duì)顱內(nèi)殘留腫瘤再生長(zhǎng)表現(xiàn)出最顯著的抑制作用（圖7d、e）。此外，接受PBS治療的小鼠出現(xiàn)輕微體重減輕，而其他組未見(jiàn)顯著體重波動(dòng)（圖7f）。接受TMZ加M@P治療的小鼠表現(xiàn)出顯著延長(zhǎng)的生存時(shí)間和更高的腫瘤細(xì)胞凋亡率（圖7g、h）。這些結(jié)果表明，TMZ和M@P的聯(lián)合治療為抑制腫瘤復(fù)發(fā)、提高生存率和改善術(shù)后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療效果提供了一種有前景的策略。

圖7 評(píng)估TMZ與M@P聯(lián)合治療對(duì)惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的療效。（a）聯(lián)合治療的示意圖；（b）手術(shù)腫瘤切除過(guò)程；（c）術(shù)后腦組織的代表性H&E圖像（標(biāo)尺：500 μm）；（d）小鼠手術(shù)切除后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的體內(nèi)成像；（e）不同治療后小鼠腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度的定量分析，灰色箭頭指示手術(shù)切除日期，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示（n=3）；（f）接受不同治療的小鼠體重變化；（g）接受不同治療的小鼠Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)；（h）各組正位腦腫瘤小鼠模型的Tunel染色圖像（標(biāo)尺：50 μm）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）計(jì)算

（8）通過(guò)TMZ和M@P聯(lián)合治療在體內(nèi)重編程腫瘤免疫微環(huán)境

研究進(jìn)一步分析了TMZ聯(lián)合M@P治療過(guò)程中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成。結(jié)果顯示，TMZ+M@P組腫瘤組織中浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞比例顯著增加至12.8%，遠(yuǎn)高于其他組；CD4+ T細(xì)胞浸潤(rùn)率也顯著提高至27.3%（圖8a、b）。在脾臟中，TMZ+M@P組CD8+ T細(xì)胞群體也顯著增加（圖8c）。此外，TMZ+M@P組小鼠淋巴結(jié)中成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）比例顯著上升至27%，而PBS組僅為9.42%（圖8d）。TMZ+M@P組還顯著降低了M2樣巨噬細(xì)胞比例，同時(shí)促炎M1樣巨噬細(xì)胞比例增加（圖8e）。此外，TMZ+M@P組產(chǎn)生最高濃度的TNF-α、干擾素（IFN）-γ和IL-6，而IL-10水平降低（圖8f）。這些結(jié)果表明，TMZ聯(lián)合M@P治療通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞組成和細(xì)胞因子水平，顯著增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖8 TMZ聯(lián)合M@P在體內(nèi)介導(dǎo)的腫瘤免疫微環(huán)境重編程。（a）流式細(xì)胞術(shù)定量分析腫瘤組織中CD8? T細(xì)胞百分比（門(mén)控于CD3? T細(xì)胞）（n=3）；（b）流式細(xì)胞術(shù)定量分析腫瘤組織中CD4? T細(xì)胞百分比（門(mén)控于CD3? T細(xì)胞）（n=3）；（c）脾臟中CD8? 和CD4? T細(xì)胞百分比的代表性流式細(xì)胞術(shù)定量分析（門(mén)控于CD3? T細(xì)胞）（n=3）；（d）不同治療后淋巴結(jié)中DCs成熟度的代表性流式細(xì)胞術(shù)定量分析（門(mén)控于CD11b?CD80?CD86?）（n=3）；（e）腫瘤組織中M1樣表型和M2樣表型巨噬細(xì)胞百分比的代表性流式細(xì)胞術(shù)定量分析（門(mén)控于CD45?CD11b?F4/80?細(xì)胞）（n=3）；（f）不同治療后血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的熱圖（n=3）。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）計(jì)算