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針對上述問題，內(nèi)華達大學(xué)拉斯維加斯分校Chandrabali Bhattacharya教授開發(fā)了一種名為內(nèi)源靶向脂質(zhì)納米顆粒（ENDO）的新平臺，通過在LNP配方中加入內(nèi)源性配體（如維生素）作為第五組分，調(diào)節(jié)其器官趨向性并增強靶向遞送能力。研究篩選了100種不同配方的LNPs，這些配方包含多種內(nèi)源性維生素、不同的離子化脂質(zhì)和獨特的配方比例，以評估其組織特異性遞送潛力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種含有膽鈣化醇作為第五組分的配方（C-CholF2和C-CholF3）可通過靜脈注射實現(xiàn)對胰腺的高選擇性mRNA遞送，其中C-CholF3在胰腺的蛋白表達效率更高，具有超過99%的選擇性和長達3天的持續(xù)表達能力。研究推測其胰腺趨向性可能與維生素D受體（VDR）介導(dǎo)的內(nèi)源靶向機制有關(guān)。此外，C-CholF3還可用于遞送其他核酸載荷，包括質(zhì)粒DNA和環(huán)狀mRNA，且具有較低的毒性、更好的安全性和耐受性。在Ai14小鼠模型中，C-CholF3 LNP還實現(xiàn)了胰腺的組織特異性基因編輯。該研究證明了將內(nèi)源性維生素作為LNP第五組分的重要性，并為靶向難以到達的肝臟外器官（如胰腺）提供了新的策略，有望用于治療目前無法治愈的胰腺疾病。該文章于2025年6月12日以《Reengineering Endogenous Targeting Lipid Nanoparticles (ENDO) for Systemic Delivery of mRNA to Pancreas》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（（DOI：10.1002/adma.202507657）。

圖1 第五組分ENDO LNP制劑及篩選平臺概覽。（a）目前開發(fā)肝外遞送系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)示意圖；（b）ENDO LNP制劑及篩選平臺示意圖；（c）不同制劑比例的餅狀圖，包括可離子化脂質(zhì)、磷脂、膽固醇、PEG脂質(zhì)和內(nèi)源性維生素第五組分

（1）ENDO LNPs 的體外篩選

傳統(tǒng)mRNA遞送用的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）由四種關(guān)鍵成分組成：離子化脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)。為增強LNPs的器官特異性遞送能力，研究中加入了維生素A、B2、D3、E和K1作為第五組分。開發(fā)了一個全面的配方庫，使用了SM-102、MC3、C12-200、THP1和306Oi10等離子化脂質(zhì)，基于基準(zhǔn)配方（摩爾比為35:16:46.5:2.5）設(shè)計了四種不同配方比例，并系統(tǒng)研究了維生素摩爾比對LNPs性能的影響（圖1C）。通過手工混合在96孔板中制備了100種不同配方的LNPs，結(jié)合了五種離子化脂質(zhì)、五種維生素和四種配方比例。動態(tài)光散射（DLS）測量顯示，大多數(shù)LNPs的平均直徑在60~140 nm之間，PDI小于0.2，與傳統(tǒng)LNPs結(jié)構(gòu)相似。

在多種細胞系（HEK293、HFF、HUVEC、RAW264.7和HMC3）中評估了所有LNPs的體外轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，與對照組MC3和SM-102相比，ENDO LNPs的轉(zhuǎn)染效率顯著提高。例如，在HEK293細胞中，以視黃醇、核黃素和葉綠醌為第五組分的LNPs轉(zhuǎn)染效率更高（圖2A）；在HFF細胞中，以視黃醇、核黃素和生育酚為第五組分的SM-102 LNPs轉(zhuǎn)染效率更高（圖2B）；在HUVEC細胞中，C12-200和306Oi10為基礎(chǔ)的LNPs表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率（圖2C）；在RAW264.7細胞中，C12-200為基礎(chǔ)的LNPs轉(zhuǎn)染效率更高（圖2D）；在HMC3細胞中，以視黃醇、核黃素和葉綠醌為第五組分的C12-200 LNPs轉(zhuǎn)染效率更高（圖2E）。這些結(jié)果表明，將維生素作為第五組分加入ENDO LNPs可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率，為實現(xiàn)組織特異性遞送提供了依據(jù)。

圖2 ENDO LNPs的體外篩選。（a）在HEK293細胞中體外遞送熒光素酶mRNA的熱圖（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），處理24小時后量化發(fā)光強度；（b）在HFF細胞中體外遞送熒光素酶mRNA的熱圖（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），處理24小時后量化發(fā)光強度；（c）在HUVEC細胞中體外遞送熒光素酶mRNA的熱圖（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），處理24小時后量化發(fā)光強度；（d）在RAW 264.7細胞中體外遞送熒光素酶mRNA的熱圖（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），處理24小時后定量分析發(fā)光強度；（e）在HMC3細胞中體外遞送熒光素酶mRNA的熱圖（每孔125 ng mRNA，96孔板，n=3），處理24小時后定量分析發(fā)光強度?？s寫：T1，THP1；C12，C12-200；SM，SM-102；306，306Oi10；F1，配方1；F2，配方2；F3，配方3；F4，配方4

（2）使用批量分析進行ENDO LNPs體內(nèi)篩選

通過綜合批量分析評估了ENDO LNPs的體內(nèi)遞送效率。研究將100種LNPs按配方比例分為四組（F1、F2、F3和F4），每組包含25種配方。這些LNPs以0.5 mg·kg?1的劑量靜脈注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，通過IVIS成像系統(tǒng)檢測主要器官的蛋白表達。結(jié)果顯示，F(xiàn)1和F4主要在肝臟表達，并在脾臟、腸道和胰腺有少量表達；F2和F3則顯著重定向到肝臟外，其中F2在胰腺表現(xiàn)出選擇性蛋白表達，而在其他器官（包括脾臟和肝臟）表達極少（圖3A）。隨后，基于離子化脂質(zhì)（THP1、C12-200、SM-102、MC3和306Oi10）將F2和F3配方分為五組，每組10種LNPs進行注射。結(jié)果表明，C12-200組在胰腺表現(xiàn)出選擇性轉(zhuǎn)染，而其他離子化脂質(zhì)組在多個器官均有表達（圖3B）。進一步將C12-200配方按不同維生素（視黃醇、核黃素、膽鈣化醇、生育酚和葉綠醌）分組，發(fā)現(xiàn)膽鈣化醇配方在胰腺表現(xiàn)出選擇性mRNA轉(zhuǎn)染和蛋白表達（圖3C）。在整個篩選過程中，SM-102和MC3作為對照，主要在肝臟積累。

圖3 使用批量分析進行ENDO LNPs體內(nèi)篩選。（a）注射后24小時的IVIS圖像及基于配方（F1、F2、F3、F4）的FLuc mRNA ENDO LNP池總通量的圖形表示，SM-102和MC3作為對照，C57BL/6小鼠靜脈注射0.5 mg·kg?1混合的ENDO LNPs（n=2只生物學(xué)獨立小鼠，±SD）。器官從左到右依次為：心臟、肺、脾、胰腺、肝臟、腸和腎臟。（b）注射后24小時的IVIS圖像及基于可離子化脂質(zhì)的FLuc mRNA ENDO LNP池總通量的圖形表示，靶向胰腺的F2和F3 LNPs按可離子化脂質(zhì)（THP1、C12-200、SM-102、MC3、306Oi10）分批處理后靜脈注射，SM-102和MC3作為對照（n=2只生物學(xué)獨立小鼠，±SD）。器官從左到右依次為：心臟、肺、脾、胰腺、肝臟、腸和腎臟。（c）注射后24小時的IVIS圖像及基于內(nèi)源性維生素的FLuc mRNA ENDO LNP池總通量的圖形表示，靶向胰腺的選擇性C12-200 ENDO LNP按維生素A（視黃醇）、B2（核黃素）、D3（膽鈣化醇）、E（生育酚）、K1（葉綠醌）分批處理后靜脈注射，SM-102和MC3作為對照（n=2只生物學(xué)獨立小鼠，±SD）。器官從左到右依次為：心臟、肺、脾、胰腺、肝臟、腸和腎臟

（3）ENDO LNP、C-CholF2 和 C-CholF3 的效果驗證

使用微流控裝置制備了C12-200膽鈣化醇F2（C-CholF2）和C12-200膽鈣化醇F3（C-CholF3）LNPs。C-CholF2和C-CholF3的粒徑和包封率（EE%）測量結(jié)果顯示，兩者粒徑相似且EE%較高，表明mRNA包封效果良好（圖4A）。將C-CholF2和C-CholF3以0.5 mg·kg?1的劑量靜脈注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，C-CholF3和C-CholF2在胰腺表現(xiàn)出選擇性表達，C-CholF3的平均總通量為1.04×10?，是C-CholF2（2.29×10?）的4.5倍，表明C-CholF3能夠以更高的效率靶向胰腺（圖4B）。通過腹腔注射途徑評估了C-CholF3的效率，平均總通量降低到5.94×10?（約為靜脈注射信號的12%），但對胰腺的選擇性仍超過99%。C-CholF3 ENDO LNPs的低溫電子顯微鏡（cryo-EM）圖像顯示其呈球形，具有多層膜殼包裹的非晶態(tài)核心（圖4D）。將0.25、0.5和1 mg·kg?1的C-CholF3 LNPs靜脈注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，觀察到明顯的劑量依賴性轉(zhuǎn)染效率提升。

圖4 頂級ENDO LNP（C-CholF2和C-CholF3）的驗證。（a）C-CholF2和C-CholF3及對照（C12-200）的物理化學(xué)特性，包括尺寸、PDI、ζ電位和mRNA包封效率（n=3，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，NS表示不顯著，采用單因素方差分析及Bonferroni事后分析）。（b）注射后24小時的代表性IVIS圖像及靜脈注射0.5 mg·kg?1的C-CholF2和C-CholF3 ENDO LNP總通量的圖形表示，PBS和C12-200作為對照（n=3只生物學(xué)獨立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，NS表示不顯著，采用單因素方差分析及Bonferroni事后分析）。器官從左到右依次為：心臟、肺、脾、胰腺、肝臟、腸和腎臟。（c）餅圖顯示靜脈注射C12-200（傳統(tǒng)四組分）并重定向至胰腺后，C-CholF2和C-CholF3 LNPs在各器官的蛋白表達百分比（n=3只生物學(xué)獨立小鼠）。（d）C-CholF3 LNPs的代表性低溫電子顯微鏡圖像，比例尺為50納米

（4）C-CholF3 ENDO LNPs的毒性和安全性評估

C-CholF3的體內(nèi)生物相容性研究顯示，其處理的胰腺組織在24小時和48小時后H&E染色未見形態(tài)學(xué)損傷或炎癥反應(yīng)（圖5A），胰島細胞保持完整，無壞死或退行性變化；肝臟組織在48小時后H&E染色也未見顯著差異。連續(xù)監(jiān)測21天體重和血液學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，小鼠體重?zé)o顯著下降，肝酶（ALT、AST、堿性磷酸酶）水平正常，未觀察到腎臟毒性（圖5B）。注射后24小時檢測的促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平與PBS對照組相當(dāng)，表明LNP低免疫原性（圖5C），其他免疫生物標(biāo)志物水平也與對照組相當(dāng)，適合LNP的重復(fù)給藥。這些結(jié)果表明，C-CholF3 ENDO LNPs具有更高的生物相容性和更低的毒性，優(yōu)于傳統(tǒng)C12-200 LNPs。

C-CholF3 LNPs在4℃和-20℃下儲存1、3、7和21天后，物理化學(xué)性質(zhì)變化極小，粒徑、PDI、ζ電位和EE%等參數(shù)保持一致。即使在無冷凍保護劑的情況下儲存21天，LNPs仍能保持穩(wěn)健的熒光素酶（FLuc）表達，表明其具有卓越的穩(wěn)定性，適合長期儲存和運輸。此外，靜脈注射C-CholF3 LNPs到C57BL/6小鼠體內(nèi)后，生物發(fā)光信號在72小時內(nèi)保持穩(wěn)?。▓DS14，補充信息），表明其在體內(nèi)具有較長的穩(wěn)定性和表達時間。

通過TNS實驗發(fā)現(xiàn)，靶向胰腺的C-CholF3 LNPs的表觀pKa值為7.31，高于靶向肝臟的C12-200 LNPs的pKa值6.71。C-CholF3 LNPs能夠遞送多種核酸載荷，包括質(zhì)粒DNA和環(huán)狀mRNA。靜脈注射含有環(huán)狀mRNA或質(zhì)粒DNA的C-CholF3 LNPs后，環(huán)狀mRNA的平均總通量為8.41×10?，質(zhì)粒DNA為1×10?，且兩者的選擇性均超過99%，表明其對不同核酸具有廣泛的兼容性。質(zhì)粒DNA可實現(xiàn)長期基因表達，環(huán)狀mRNA則具有更高的穩(wěn)定性和更低的免疫原性?？傮w而言，C-CholF3 LNPs是一種安全且高效的胰腺靶向核酸治療遞送方法，對胰腺癌和糖尿病治療具有重要意義。

圖5 C-CholF3 ENDO LNPs的毒性和安全性評估。（a）C57BL/6小鼠靜脈注射包裹FLuc mRNA的C-CholF3和PBS（對照，劑量0.5 mg·kg?1）后，胰腺（處理后24和48小時）和肝臟切片（處理后48小時）的代表性組織學(xué)圖像，蘇木精-伊紅（H&E）染色，放大倍數(shù)40倍，比例尺60 μm（n=3只生物學(xué)獨立小鼠）。（b）靜脈注射PBS、C-CholF3和C12-200 LNPs（劑量0.5 mg·kg?1）后24小時，血清肝酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST）、腎臟參數(shù)（血尿素氮BUN和肌酐）水平（n=3，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；NS表示不顯著，采用單因素方差分析和Bonferroni事后分析）。（c）以0.5 mg·kg?1劑量靜脈注射C-CholF3和C12-200 LNPs的小鼠體內(nèi)IL-6、IL-1β和TNFα水平（n=3只生物學(xué)獨立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；NS表示無顯著性，采用單因素方差分析和Bonferroni事后分析），以注射PBS的小鼠作為對照組

（5）C-CholF3 ENDO LNPs 內(nèi)源性靶向胰腺的機制探究

C-CholF3 ENDO LNPs實現(xiàn)胰腺選擇性遞送的機制研究結(jié)果如下：共聚焦顯微鏡觀察顯示，DiO標(biāo)記的C-CholF3 LNPs在BxPC-3細胞中處理2小時后與LysoTracker標(biāo)記的內(nèi)體/溶酶體明顯共定位，表明其有效內(nèi)化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸（圖6A）。C-CholF3處理的細胞DiO熒光強度顯著高于MC3處理的細胞，提示其細胞攝取能力更強，推測與受體介導(dǎo)的內(nèi)化途徑有關(guān)。由于C-CholF3配方中含有膽鈣化醇作為第五組分，推測其可能通過與維生素D受體（VDR）的相互作用實現(xiàn)胰腺細胞的選擇性攝取。

在體內(nèi)研究中，使用VDR的拮抗劑MeTC7預(yù)處理C57BL/6小鼠（50 mg·kg?1），12小時后靜脈注射包裹Fluc mRNA的C-CholF3 ENDO LNPs（0.5 mg·kg?1）（圖6B）。注射后24小時的IVIS成像顯示，PBS處理的小鼠胰腺中熒光素酶表達強烈，證實了C-CholF3的胰腺靶向性（圖6C），而MeTC7預(yù)處理的小鼠胰腺信號完全消失，表明功能性VDR對組織選擇性遞送至關(guān)重要，MeTC7破壞了VDR與C-CholF3 LNPs的相互作用。此外，MC3 LNPs在MeTC7處理的小鼠中仍表現(xiàn)出強烈的肝臟蛋白表達，符合ApoE介導(dǎo)的肝臟靶向機制。

進一步驗證VDR的作用，將MeTC7作為第五組分替代膽鈣化醇，制備了靶向胰腺的LNPs。以0.5 mg·kg?1的劑量靜脈注射MeTC7 LNPs后，24小時的IVIS成像顯示胰腺中選擇性且強烈的熒光素酶表達（圖6D），表明MeTC7嵌入LNP后可與VDR相互作用，類似于膽鈣化醇，從而促進高效的胰腺靶向。這進一步證實了LNP與VDR之間的直接相互作用，支持了一種新的VDR介導(dǎo)的遞送機制。

圖6 C-CholF3 ENDO LNPs內(nèi)源性靶向胰腺的機制探究。（a）共聚焦顯微鏡圖像顯示DiO標(biāo)記的C-CholF3和MC3 LNPs在BxPC-3細胞中的攝取和細胞內(nèi)運輸情況。細胞用LysoTracker Red（內(nèi)體/溶酶體）和Hoechst 33342（細胞核）染色，處理后2小時成像以觀察納米顆粒定位，比例尺10 μm，放大60倍（n=3）。（b）使用MeTC7阻斷VDR的示意圖。小鼠腹膜內(nèi)注射50 mg·kg?1 MeTC7，12小時后靜脈注射mRNA LNPs。（c）為研究VDR作用，小鼠在注射LNP前12小時預(yù)先注射VDR拮抗劑MeTC7或PBS（對照）。C57BL/6小鼠靜脈注射LNP（0.5 mg·kg?1）后24小時的代表性IVIS圖像（n=4只生物學(xué)獨立小鼠）。器官從左到右依次為：心臟、肺、脾、胰腺、肝臟、腎臟和腸道。（d）代表性IVIS圖像、總通量的圖形表示和餅圖，說明注射C-CholF3 LNP（以MeTC7代替膽鈣化醇作為第五種成分）后24小時各器官的蛋白表達百分比。小鼠接受靜脈注射，劑量為0.5 mg·kg?1（n=3只生物學(xué)獨立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS表示不顯著，采用雙尾非配對t檢驗）。器官從左到右依次為：心臟、肺、脾、胰腺、肝臟、腎臟和腸道

（6）利用 C-CholF3 ENDO LNPs 在胰腺中高效且組織特異性地表達 tdTomato

利用Ai14小鼠模型評估了C-CholF3 LNPs的組織特異性基因編輯能力。該模型含有Cre介導(dǎo)基因編輯的構(gòu)建，CAG啟動子下游有LoxP-stop-LoxP盒，成功遞送Cre重組酶后可激活tdTomato熒光（圖7A）。將包裹Cre重組酶mRNA的C-CholF3 LNPs以1.5 mg·kg?1的劑量靜脈注射到Ai14小鼠體內(nèi)，120小時后熒光成像顯示胰腺中tdTomato表達強烈，選擇性超過99%（圖7B、圖7C），而其他組織熒光不顯著。免疫熒光分析顯示，胰島素抗體染色的β細胞中出現(xiàn)tdTomato熒光，表明C-CholF3 ENDO LNPs在胰腺β細胞中實現(xiàn)了有效的基因編輯（圖7D），但這種遞送并非僅限于β細胞。這些結(jié)果表明，該遞送系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)胰腺主要細胞類型的基因表達，有望用于胰腺疾病的靶向治療。

為了評估C-CholF3 LNPs的臨床轉(zhuǎn)化潛力，將其安全性與已獲批的MC3配方（Onpattro）進行了比較。在注射后4小時和24小時評估了C-CholF3和MC3的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率和毒性特征。IVIS成像顯示，C-CholF3在4小時時已在胰腺積累，平均總通量為3.52×10?，且在肝臟清除后未發(fā)生再分布；而MC3主要在肝臟積累，平均總通量為2.26×10?。24小時時，IVIS圖像顯示C-CholF3在胰腺的轉(zhuǎn)染效率高于MC3，平均總通量分別為3.47×10?和3.24×10?。安全性評估表明，C-CholF3的血清肝酶ALT和AST水平低于MC3，兩者對腎臟功能參數(shù)影響相似，且C-CholF3的細胞因子譜更優(yōu)，其中IL-6水平顯著低于MC3，而IL-1β水平高于MC3，總體支持C-CholF3具有更優(yōu)的安全性。

圖7 利用C-CholF3 ENDO LNPs在胰腺中高效且組織特異性地表達tdTomato。（a）Cre mRNA遞送及Cre介導(dǎo)的終止盒移除示意圖，激活A(yù)i14 Cre-loxP小鼠模型中的tdTomato表達，通過靜脈注射含Cre mRNA的LNPs并使用IVIS成像胰腺。（b）注射后120小時胰腺中tdTomato的代表性表達及含Cre mRNA的C-CholF3 LNPs總通量的圖形表示，以及以1.5 mg·kg?1劑量靜脈注射到Ai14小鼠的PBS處理對照（n=4只生物學(xué)獨立小鼠，±SD，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS表示不顯著，采用雙尾非配對t檢驗）。（c）餅圖說明靜脈注射含Cre mRNA的C-CholF3 LNPs后胰腺和肝臟中蛋白表達的百分比（n=4只生物學(xué)獨立小鼠）。（d）Ai14小鼠靜脈注射1.5 mg·kg?1劑量的包裹Cre mRNA的C-CholF3 LNPs和PBS（對照）后120小時胰腺切片的代表性免疫熒光圖像，使用胰島素抗體對β細胞染色，DAPI標(biāo)記細胞核，圖像采集自三只生物學(xué)獨立小鼠，放大40倍