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針對(duì)上述問(wèn)題，復(fù)旦大學(xué)仰大勇教授和天津大學(xué)姚池教授團(tuán)隊(duì)及合作者在DNA功能材料用于黑色素瘤光免疫治療方面取得新進(jìn)展，發(fā)展了能夠在腫瘤部位特異性啟動(dòng)光動(dòng)力單元以及核酸藥物釋放的智能DNA水凝膠，在無(wú)需激光照射條件下可實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的按需光免疫治療。研究人員設(shè)計(jì)了一種智能能量存儲(chǔ)DNA水凝膠，通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）反應(yīng)構(gòu)建，整合了多種組件：PD-1抑制劑（PD-1 aptamer, Apt PD-1）、免疫佐劑（CpG ODN）、能量存儲(chǔ)光動(dòng)力模塊（ES-PMSA）。該水凝膠能夠響應(yīng)多種腫瘤標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)激光自由、按需激活的光免疫療法，實(shí)現(xiàn)靶向藥物釋放，用于局部黑色素瘤的治療。該文章于2025年6月4日以《Smart Energy-Storing DNA Hydrogel for On-Demand Laser-Free Photoimmunotherapy of Melanoma》為題發(fā)表于《Journal of the American Chemical Society》上（DOI:10.1021/jacs.5c06905）。

研究示意圖

（1）智能能量?jī)?chǔ)存DNA水凝膠的制備與表征

本研究通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）策略構(gòu)建了兩條部分互補(bǔ)的DNA鏈，形成智能儲(chǔ)能DNA水凝膠網(wǎng)絡(luò)。非變性PAGE證實(shí)線(xiàn)性模板成功環(huán)化為circDNA，DNA鏈1和鏈2因高分子量在PAGE中被阻滯，表明構(gòu)建成功（圖1A）。圓二色性（CD）光譜中276 nm處的重疊峰表明Apt PD-1成功引入CS-template-1（圖1B）。在K?存在下，AS1411序列形成G四鏈體結(jié)構(gòu)并與SiPcCl2組裝成復(fù)合物，CD譜峰藍(lán)移驗(yàn)證了該復(fù)合物的構(gòu)建（圖1C）。ES-PM納米顆粒通過(guò)以下步驟合成：紫外線(xiàn)照射胺修飾的PLNPs生成儲(chǔ)能PLNPs（ES-PLNPs），再用MnO2殼包封得到ES-PM納米顆粒。ES-PM納米顆粒與SiPcCl2-AS1411通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，形成ES-PMSA納米復(fù)合物（圖1D）。zeta電位測(cè)量顯示ES-PMSA的zeta電壓為-36.4 mV，表明其成功形成（圖1E）。動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量顯示ES-PMSA的流體動(dòng)力學(xué)直徑為92.5 nm（圖1F）。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示水凝膠具有均勻多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于藥物裝載（圖1G）。流變學(xué)分析表明，儲(chǔ)能模量（G'）高于損耗模量（G''），水凝膠具有類(lèi)固體性質(zhì)和高度柔軟性，賦予其良好的注射性和組織貼合能力（圖1H）。X射線(xiàn)光電子能譜（XPS）證明水凝膠中成功嵌入了ES-PMSA和SiPcCl?（圖1I）。

圖1 智能儲(chǔ)能DNA水凝膠的制備及表征。（A）不同的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（B）的圓二色性光譜。（C）AS1411+K+和AS1411+K++SiPcCl2的圓二色性光譜。（D） ES-PMSA分子結(jié)構(gòu)示意圖。（E）不同樣品的Zeta電位。（F）不同樣品的DLS。（G）水凝膠的SEM圖像。（H）水凝膠流變測(cè)試。（I）X射線(xiàn)光電子能譜

（2）智能儲(chǔ)能DNA水凝膠多重刺激響應(yīng)的研究

為實(shí)現(xiàn)按需釋放，水凝膠整合了多重腫瘤微環(huán)境響應(yīng)模塊。首先，通過(guò)含有Apt PD-1序列的CS-template-1與T細(xì)胞特異性識(shí)別，觸發(fā)CpG ODN的釋放，PAGE檢測(cè)驗(yàn)證了T細(xì)胞介導(dǎo)的釋放行為（圖2A）。進(jìn)一步地，引入攜帶HhaI限制性?xún)?nèi)切酶的TGMS納米顆粒，通過(guò)蛋白酶觸發(fā)HhaI釋放，該酶可特異切割DNA鏈2中的回文序列（GCGC），實(shí)現(xiàn)ES-PMSA的精準(zhǔn)釋放。凝膠電泳顯示在蛋白酶存在下出現(xiàn)裂解帶，證實(shí)該酶響應(yīng)機(jī)制有效（圖2B）。采用1%的凝膠分離法，研究蛋白酶溶液中酶的時(shí)間依賴(lài)性斷裂。蛋白酶組中出現(xiàn)了裂解帶，而沒(méi)有蛋白酶組的孔中保留帶，這表明腫瘤部位的酶能夠觸發(fā)HhaI釋放（圖2C）。通過(guò)釋放的Mn²⁺有效地催化過(guò)氧化氫（H₂O₂）轉(zhuǎn)化為氧氣（O₂），為PDC提供了增強(qiáng)的O₂供應(yīng)。ES-PMA（不含SiPcCl₂）溶液在日光和紫外光下表現(xiàn)出深棕色分散體。在GH存在的情況下，在紫外線(xiàn)照射下觀(guān)察到深棕色溶液變成白色和紅色熒光，表明持續(xù)發(fā)光的GH響應(yīng)性恢復(fù)（圖2D、E）。此外，ES-PMSA具GSH響應(yīng)性。在還原性條件下（模擬腫瘤內(nèi)GSH濃度），ES-PMA溶液發(fā)生光學(xué)性質(zhì)變化，發(fā)光恢復(fù)隨GSH濃度升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的GSH響應(yīng)特性。（圖2F）。熒光譜顯示ES-PLNP的發(fā)射峰與SiPcCl₂的吸收峰高度重疊，有利于能量轉(zhuǎn)移和ROS生成。使用SOSG探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ES-PMSA可在無(wú)外源光照下激活產(chǎn)生¹O₂，明顯優(yōu)于無(wú)儲(chǔ)能模塊對(duì)照組，表明其具自發(fā)激活光動(dòng)力功能。

圖2 智能儲(chǔ)能DNA水凝膠的多重刺激響應(yīng)性。（A）PAGE驗(yàn)證CpG加載及T細(xì)胞誘導(dǎo)釋放。（B） HhaI @ TGMS納米顆粒響應(yīng)釋放ES-PMSA的示意圖。（C）PAGE驗(yàn)證蛋白酶介導(dǎo)DNA鏈切割以釋放光動(dòng)力模塊。（D） GSH響應(yīng)下5G溶液在日光和UV照射下的照片。（E） ES-PMA和ES-PLNP的熒光光譜。（F）不同GSH濃度恢復(fù)ES-PMA的熒光光譜。（G） PLNP溶液和SiPcCl₂吸收光譜。（H） SOSG檢測(cè)ES-PMSA的ROS生成

（3）對(duì)B16癌細(xì)胞無(wú)激光光動(dòng)力療法性能研究

光動(dòng)力模塊（ES-PMSA）通過(guò)核苷介導(dǎo)的細(xì)胞吸收被B16細(xì)胞內(nèi)化，腫瘤內(nèi)GSH觸發(fā)活性氧（ROS）產(chǎn)生，促進(jìn)無(wú)激光光動(dòng)力療法（PDT）效果（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，B16細(xì)胞與Cy5標(biāo)記的ES-PMSA孵育4小時(shí)后熒光強(qiáng)度顯著增加，而Smooth細(xì)胞（ASMC）、DC和T細(xì)胞熒光變化較小，表明ES-PMSA通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被B16細(xì)胞吸收（圖3B）。熒光強(qiáng)度分析表明，ES-PMSA和ES-PMSA-G+H組顯著增加綠色熒光，而PMA、ES-PMA或PMSA組未觀(guān)察到顯著熒光，說(shuō)明ES-PMSA有效誘導(dǎo)B16細(xì)胞中ROS產(chǎn)生（圖3C）。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，ES-PMSA和ES-PMSA-G-H組細(xì)胞存活率顯著降低，表明無(wú)激光PDT取得良好治療效果（圖3D）。通過(guò)ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)B16細(xì)胞ATP分泌水平，ES-PMSA和ES-PMSA-G-H組ATP分泌顯著高于其他組（圖3E）。免疫熒光染色顯示，ES-PMSA和ES-PMSA-G-H組細(xì)胞表面CRT暴露顯著增加（圖3F、G），而HMGB1綠色熒光顯著減少，表明無(wú)激光PDT有效促進(jìn)HMGB1釋放（圖3H、I）。這些結(jié)果表明，無(wú)激光PDT可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）反應(yīng)，促進(jìn)后續(xù)免疫細(xì)胞激活。

圖3 無(wú)激光光動(dòng)力治療(PDT)誘導(dǎo)B16癌細(xì)胞免疫原性細(xì)胞死亡。（A） GSH刺激下無(wú)激光ROS生成用于腫瘤殺傷的示意圖。（B）流式細(xì)胞術(shù)分析ES-PMSA內(nèi)化到B16細(xì)胞，DC和CTLL-2作為對(duì)照。（C）不同組分在8小時(shí)對(duì)B16細(xì)胞中的ROS生成的熒光顯微鏡和ES-PMSA-G圖像。（D）CCK-8測(cè)定不同組分對(duì)B16細(xì)胞存活率。（E）不同處理后細(xì)胞外 ATP的定量。（F）不同組分處理后，與鈣網(wǎng)蛋白 (CRT) 熒光探針 (綠色) 和DAPI (藍(lán)色) 孵育的B16細(xì)胞的CLSM圖像。（G）CRT的相應(yīng)相對(duì)熒光強(qiáng)度。（H）不同組分處理后，B16細(xì)胞與HMGB1蛋白熒光探針 (HMGB1，綠色) 和DAPI (藍(lán)色) 孵育的CLSM圖像。（I）HMGB1的相對(duì)熒光強(qiáng)度

（4）CpG釋放對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答及樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）成熟的影響研究

CpG ODN是含有未甲基化CpG基序的短DNA序列，可激活DC增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。智能儲(chǔ)能DNA水凝膠與T細(xì)胞孵育時(shí)，通過(guò)Apt PD-1與T細(xì)胞的特異性識(shí)別結(jié)合釋放CBP，進(jìn)而刺激DC成熟（圖4A）。熒光實(shí)驗(yàn)顯示，紅色熒光標(biāo)記的Apt PD-1與綠色熒光標(biāo)記的T細(xì)胞共定位，產(chǎn)生強(qiáng)烈黃色熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照組（NC）重疊極小，Apt PD-1組Pearson系數(shù)顯著高于NC組，表明Apt PD-1特異性識(shí)別T細(xì)胞并成功釋放PGP ODN（圖4B）。綠色熒光染色的DNA水凝膠與紅色熒光標(biāo)記的T細(xì)胞孵育結(jié)果顯示，含有Apt PD-1序列的水凝膠熒光強(qiáng)度顯著高于不含Apt PD-1的NC組，驗(yàn)證了DNA水凝膠與T細(xì)胞的特異性識(shí)別（圖4C）。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ISA）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Gel-ATG +T組上清中免疫細(xì)胞因子濃度最高，腫瘤壞死因子-α為2000.7 μg/mL，IL-6為2450.2 μg /mL，而缺乏CBP釋放的組細(xì)胞因子水平顯著降低（圖4D、E），表明T細(xì)胞可觸發(fā)DNA水凝膠釋放ATG ODN，刺激BMDCs分泌免疫細(xì)胞因子。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BPDC表面CD80和CD86蛋白表達(dá)水平，Gel-ATG +T組CD80蛋白表達(dá)量從15.2%增加到53.6%，CD86蛋白表達(dá)量從14.9%增加到55.8%，而未釋放ATG的組變化不足20.0%（圖4F、G），表明釋放的ATG ODN激活了DC?？傮w而言，T細(xì)胞觸發(fā)釋放的CBP ODN可促進(jìn)不成熟DC成熟，激活T細(xì)胞以清除腫瘤細(xì)胞。

圖4 T細(xì)胞反應(yīng)性釋放CpG促進(jìn)DC體外成熟。（A）T細(xì)胞觸發(fā)的CpG釋放以促進(jìn)用于T細(xì)胞活化的DC成熟的示意圖。（B）用Cy5-labeled Apt PD-1and Cy5-labeled NC孵育的DiO染色的T細(xì)胞的代表性熒光顯微鏡圖像 (非相關(guān)序列)。（C）具有和不具有Apt PD-1的DNA網(wǎng)絡(luò)捕獲的T細(xì)胞的代表性熒光顯微鏡圖像。（D，E）測(cè)試不同材料BMDC細(xì)胞上清液TNF-α和 IL-6的分泌水平。（F，G）流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DC (BMDCs) 上CD80和CD86表達(dá)水平及評(píng)估DC成熟度

（5）TAA和ATG對(duì)B16細(xì)胞的免疫治療性能

智能儲(chǔ)能DNA水凝膠通過(guò)誘導(dǎo)PDC效應(yīng)釋放TAA，并編碼Apt PD-1富集腫瘤部位的T細(xì)胞，同時(shí)充當(dāng)免疫檢查點(diǎn)阻滯劑。T細(xì)胞從Apt PD-1中取代ATG ODN并釋放CBP ODN以促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)T細(xì)胞抗腫瘤能力（圖5A）。實(shí)驗(yàn)中，將TAA組（B16細(xì)胞來(lái)源的TAA）和CPD T組（T細(xì)胞觸發(fā)釋放的CPD ODN）與BMDCs共孵育，檢測(cè)BMDCs表面CD80和CD86表達(dá)以及上清中腫瘤壞死因子-α和IL-6濃度。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，TAA+CPGT組（同時(shí)添加TAA和CPD ODN）的CD80和CD86表達(dá)率最高，分別為48.0%和46.9%，其他組依次為PBS組、TAA組、CPGT組（圖5B、C）。TAA+CPGT組的腫瘤壞死因子-α和IL-6水平顯著高于其他組（圖5D、E），表明TAA和ATG ODN可協(xié)同促進(jìn)DC成熟。通過(guò)DDD-8試驗(yàn)檢測(cè)成熟BMDCs激活T細(xì)胞的能力，TAA+CPGT組的T細(xì)胞存活率最高，為462.9%，顯著高于單一抗原組（圖5F），說(shuō)明TAA與ATG ODN聯(lián)合可有效調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。此外，通過(guò)混合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（DC、T細(xì)胞和B16細(xì)胞）評(píng)估智能儲(chǔ)能DNA水凝膠的協(xié)同抗腫瘤效果。實(shí)驗(yàn)中，不同組的DNA凝膠與細(xì)胞共孵育后，熒光顯微鏡記錄紅色熒光B16細(xì)胞（圖5G）。結(jié)果顯示，含有Apt PD-1、ATG和ES-PMSA的DNA凝膠（第VII組）對(duì)B16細(xì)胞的殺傷效果最強(qiáng)，紅色熒光強(qiáng)度最弱，表明無(wú)激光光動(dòng)力療法（ES-PMSA）、免疫佐劑（ATG）和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Apt PD-1）的聯(lián)合治療具有顯著的協(xié)同抗腫瘤作用。

圖5 TAAs和CpG對(duì)B16細(xì)胞的免疫治療性能。（A） TAAs和CpG協(xié)同免疫治療示意圖。（B，C）流式細(xì)胞術(shù)分析BMDCs上CD80和CD86的表達(dá)。（D，E） ELISA測(cè)定不同處理的BMDCs培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6的濃度。（F） CCK-8法評(píng)估BMDCs分泌因子處理的T細(xì)胞增殖率。（G）共培養(yǎng)T細(xì)胞和DCs與B16細(xì)胞的熒光顯微鏡圖像

（6）智能儲(chǔ)能DNA水凝膠在體內(nèi)治療的評(píng)價(jià)

建立了原位黑色素瘤小鼠模型，以研究智能儲(chǔ)能DNA水凝膠的體內(nèi)治療性能。35只荷B16腫瘤小鼠隨機(jī)分為7組，每3天通過(guò)瘤內(nèi)注射不同組分的藥物（圖6A）。結(jié)果顯示，v-VII組腫瘤生長(zhǎng)呈減速趨勢(shì)，優(yōu)于iii和iv組的單藥治療（圖6B）。隨后提取腫瘤并拍照稱(chēng)重，腫瘤照片顯示智能儲(chǔ)能DNA水凝膠對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有顯著抑制作用（圖6C）。腫瘤重量分析表明，組ii、iii、iv、v、vi和VII的腫瘤抑制率分別為4.0%、18.3%、33.6%、49.4%、53.8%和73.3%（圖6D）。與對(duì)照組（i）相比，含有Apt PD-1、ATG和ES-PMSA的DNA凝膠（VII組）顯示出最強(qiáng)的腫瘤抑制效果。含有ES-PMSA的DNA凝膠（iv組）也表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，證明ES-PMSA從DNA水凝膠中釋放并實(shí)現(xiàn)了無(wú)激光光動(dòng)力療法。與iv組相比，含有Apt PD-1、ATG和ES-PMSA的DNA凝膠（vi組）進(jìn)一步減少了腫瘤，表明釋放的ATG ODN、TAA和Apt PD-1可有效增強(qiáng)免疫治療。

圖6 智能儲(chǔ)能DNA水凝膠在原位黑色素瘤小鼠模型中的抗腫瘤性能。（A）建立和治療B16黑色素瘤小鼠模型的示意圖。（B）不同組中的平均腫瘤生長(zhǎng)概況。（C）切除腫瘤的圖像。（D）不同組中平均腫瘤重量的統(tǒng)計(jì)。（E） 用Cy5和DAPI分別染色的腫瘤切片的CRT (紅色) 和細(xì)胞核 (藍(lán)色) 的免疫熒光圖像。（F）流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定提取的腫瘤組織中CD80、CD86和CD8的分泌水平。 （G）不同組的H & E染色的腫瘤