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上海交通大學周明良、蔣欣泉團隊提出一種基于工程化巨噬細胞膜偽裝的納米誘餌（LMCNDs）治療牙周炎的策略。LMCNDs將重組人抗菌肽LL-37錨定于富含Toll樣受體的巨噬細胞膜上，并結(jié)合級聯(lián)催化系統(tǒng)（包括L-氨基酸氧化酶和中空二氧化錳）。該策略通過巨噬細胞膜偽裝增強細菌靶向性和組織保留能力；LL-37破壞細菌膜完整性，實現(xiàn)高效殺菌；級聯(lián)催化系統(tǒng)加速氧氣生成、擾亂病原菌代謝，改善缺氧微環(huán)境。同時，LMCNDs觸發(fā)NF-E2相關(guān)因子-2（NRF2）核轉(zhuǎn)位，減輕氧化應激，調(diào)控巨噬細胞極化，促進成骨細胞成骨分化。相關(guān)成果于2025年4月10日以《Engineered Macrophage Membrane-Camouflaged Nanodecoys Reshape the Infectious Microenvironment for Efficient Periodontitis Treatment》為題發(fā)表于《ACS Nano》。（DOI：10.1021/acsnano.4c14305）。

研究示意圖

（1）LMCNDs 的制備與表征

為制備重組人LL-37（rhLL-37）修飾的活化巨噬細胞膜，將設(shè)計的慢病毒載體轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，并用牙齦卟啉菌源性脂多糖（LPS）處理（圖1A）。免疫染色結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞（RawrhLL-37OE）表面LL-37水平升高，LPS處理增強巨噬細胞中TLR2/4的表達，且LPS孵育略微增加細胞質(zhì)中LL-37的表達（圖1B）。收集rhLL-37修飾的巨噬細胞膜（acLMMs），通過聚碳酸酯多孔膜反復擠壓制備acLMM囊泡。LMCNDs的核心是載有L-氨基酸氧化酶（LAAO）的中空二氧化錳（hMnO?），其LAAO負載效率和容量分別為50.1±5.19%和326.3±35.52 μg/mg。通過超聲和連續(xù)擠壓acLMM囊泡與LAAO?hMnO?納米顆粒（NPs）的混合物獲得LMCNDs。透射電子顯微鏡（TEM）顯示LAAO?hMnO?NPs呈典型球形且具有空心結(jié)構(gòu)，LMCNDs呈均勻且單分散的球形“核殼”形態(tài)，TEM元素映射觀察到LMCNDs外層中的碳、氧、氮和錳元素，證實了LAAO?hMnO?核心的成功封裝（圖1C）。LMCNDs的zeta電位與acLMMs相近，與LAAO?hMnO?有顯著差異，表明細胞膜成功包覆于載體上（圖1D）。動態(tài)光散射（DLS）顯示，acLMM囊泡的平均直徑為162.46nm，LAAO?hMnO?的尺寸因acLMMs的包覆從130.06增加到179.3nm（圖1E）。WB結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染和LPS刺激顯著增強巨噬細胞中LL-37、TLR2和TLR4的表達，acLMM囊泡和LMCNDs的蛋白譜與活化巨噬細胞高度相似，表明保留了LL-37和病原體靶向受體。這些結(jié)果表明修飾后的巨噬細胞膜成功裝飾于納米顆粒，并保留了納米誘餌精準遞送的關(guān)鍵受體。

圖1 LMCNDs的制備與表征。（a）rhLL-37質(zhì)粒設(shè)計及LMCNDs制備示意圖；（b）免疫染色評估不同巨噬細胞蛋白水平，RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染慢病毒后記為RawLL-37OE；（c）透射電子顯微鏡（TEM）及元素映射觀察結(jié)果；（d）LAAO?hMnO?納米顆粒、活化巨噬細胞膜（acMMs）、經(jīng)LL-37修飾的活化巨噬細胞膜（acLMMs）及LMCNDs的Zeta電位；（e）通過動態(tài)光散射（DLS）測量的平均粒徑；（f）通過西方印跡分析表面蛋白譜

（2）LMCNDs 的生物相容性與催化性能評估

研究人員評估了LMCNDs的生物安全性、產(chǎn)氧能力及活性氧（ROS）清除能力。在L929細胞、MC3T3細胞和RAW264.7細胞中測試發(fā)現(xiàn)，acLMMs具有劑量依賴性的輕微細胞毒性，2 mg/mL以下的acLMMs對細胞活力幾乎無影響，后續(xù)實驗采用1 mg/mL的acLMMs制備樣品（圖2A）。優(yōu)化LAAO?hMnO?納米顆粒濃度時，增加LAAO?hMnO?可加速氧氣生成，但包載于acLMMs中會降低細胞活力，超過200 μg/mL時顯著誘導細胞凋亡，因此選擇200 μg/mL和1 mg/mL分別為LMCNDs的納米顆粒核心和細胞膜包覆層的最佳濃度（圖2B、圖2C）。LMCNDs在80分鐘內(nèi)可清除近80%的H?O?，且細胞膜包覆層未干擾hMnO?介導的催化反應（圖2D）。200 μg/mL的LAAO?hMnO?包載于acLMMs中可中和細胞內(nèi)ROS，具有滿意的生物安全性（圖2E）。LMCNDs在生理溫度下保持穩(wěn)定的催化能力，反應速率與LAAO相當，且在反應后期催化速率超過LAAO（圖2F）。pH變化對H?O?分解影響較小，不同pH下L-Trp的氧化程度雖有波動，但幾乎有一半被催化（圖2G、圖2H）。LMCNDs在H?O?和L-Trp混合溶液中產(chǎn)氧能力更強，歸因于LAAO提供的過量局部H?O?（圖2I）。在缺氧條件下，LMCNDs因封裝的hMnO?持續(xù)供應氧氣，繼續(xù)消耗L-Trp，而LAAO組中L-Trp濃度保持在總量的近90%（圖2J）。

圖2 LMCNDs的生物相容性與催化性能評估。（a）不同濃度LAAO?hMnO?的產(chǎn)氧能力；（b）封裝不同劑量LAAO?hMnO?的LMCNDs的生物相容性；（c）用不同濃度LAAO?hMnO?處理的細胞凋亡情況；（d）LMCNDs對H?O?的清除能力；（e）DCFH染色評估細胞內(nèi)ROS水平；（f）不同樣品的L-Trp消耗量；（g）不同pH條件下LMCNDs的催化效率；（h）不同pH條件下LMCNDs的催化效率；（i）不同樣品催化的O?產(chǎn)生量；（j）在37°C、pH=7.4的缺氧條件下，不同組L-Trp濃度的變化

（3）LMCNDs 的抗菌特性

臨床前實驗和臨床試驗結(jié)果表明，微生物群生物膜可能在24小時內(nèi)迅速形成，強調(diào)了藥物保留時間超過24小時的重要性。為評估LMCNDs在牙周袋中的保留情況，將FITC標記的納米顆粒用acLMMs包裹后注入患有牙周炎的小鼠牙齦袋中。水凝膠組中，F(xiàn)ITC標記的納米顆粒在12小時內(nèi)迅速減少，48小時后熒光信號消失；LMMs涂層延長了納米顆粒在組織中的保留時間至24小時，但48小時后幾乎無法檢測；而acLMMs包裹的納米顆粒在組織中的保留時間顯著延長至48小時，表明其具有高效的細菌結(jié)合能力（圖3A）。與四環(huán)素纖維和米諾環(huán)素軟膏等商業(yè)產(chǎn)品相比，LMCNDs實現(xiàn)了更高的組織保留效率且臨床操作更便捷。體外測試表明，acLMMs顯著增強了對牙齦卟啉單胞菌（P.g.）和福賽擬桿菌（F.n.）的抗菌效果，且呈劑量依賴性，在2 mg/mL時達到峰值（圖3B、C）。LAAO?hMnO?的協(xié)同作用進一步提高了抗菌效果，使1 mg/mL的acLMMs（即LMCNDs）的抗菌活性提升至與2 mg/mL的acLMMs相當?shù)乃?。高分辨率熒光顯微鏡和透射電子顯微鏡（TEM）揭示了LMCNDs的作用機制：LMCNDs通過TLR2、TLR4和LPS之間的特異性親和力粘附到細菌上，再通過rhLL-37介導的膜融合整合到細菌膜中，最終通過rhLL-37的成孔效應破壞細菌膜完整性導致細胞裂解（圖3D、E）。此外，LMCNDs對生物膜形成有顯著抑制效果，與對照組相比，acLMMs和LMCNDs組中表示死亡微生物的紅色熒光信號比例顯著增加，生物膜厚度急劇減少（圖3F、G）

圖3 LMCNDs的抗菌特性。（a）通過活體成像系統(tǒng)測試FITC標記的納米顆粒在不同涂層下的牙周袋保留情況，涂層包括水凝膠、GelMA、LMMs、acLMMs；（b）不同樣品對P.g.和F.n.的體外抗菌效果；（c）P.g.和F.n.的菌落形成單位計數(shù)；（d）通過高分辨率熒光顯微鏡觀察LMCNDs的殺菌過程，箭頭指示LMCNDs；（e）通過TEM觀察LMCNDs的殺菌過程，箭頭指示LMCNDs；（f）不同處理對細菌生物膜的死/活染色；（g）生物膜厚度分析

（4）LMCNDs 對巨噬細胞極化及成骨細胞成骨分化的調(diào)節(jié)作用

LMCNDs在脂多糖（LPS）刺激下可逆轉(zhuǎn)M1/M2巨噬細胞比例（圖4A）。LPS使巨噬細胞中M1標志物iNOS顯著上調(diào)，acLMMs抑制M1極化并增強M2標志物CD206表達。LMCNDs孵育使M2標志物最顯著上調(diào)，M1標志物最顯著下調(diào)，成功實現(xiàn)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變。巨噬細胞基因表達譜進一步證實了LMCNDs的免疫調(diào)節(jié)作用（圖4B）。研究人員提取經(jīng)LPS處理（有或無LMCNDs）的巨噬細胞培養(yǎng)液，與成骨培養(yǎng)液混合制成條件培養(yǎng)液（CM），誘導成骨細胞成骨分化。結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組細胞外基質(zhì)礦化受損，ALP和ARS染色較淺；LPS + LMCNDs組染色最深（圖4D）。ALP定量分析表明LMCNDs挽救了炎癥微環(huán)境對鈣沉積和礦化結(jié)節(jié)形成的負面影響（圖4E）。qPCR分析顯示，成骨標志物在LPS組中下調(diào)，但在LPS + LMCNDs組中恢復（圖4F）。這些結(jié)果表明LMCNDs通過重塑巨噬細胞表型，重構(gòu)炎癥微環(huán)境，挽救了成骨細胞的成骨分化潛能。

圖4 LMCNDs對巨噬細胞極化及成骨細胞成骨分化的調(diào)節(jié)作用。（a）通過免疫染色檢測巨噬細胞中M1標志物（iNOS）和M2標志物（CD206）的表達；（b）不同條件下巨噬細胞表面標志物的表達譜；（c）制備用于成骨誘導的條件培養(yǎng)液（CM）；（d）經(jīng)不同CM誘導7天和14天后成骨細胞的ALP和ARS染色；（e）ALP活性定量分析；（f）成骨相關(guān)基因表達的qPCR分析

（5）LMCNDs 介導的巨噬細胞極化機制

LMCNDs在感染微環(huán)境下恢復巨噬細胞極化平衡的機制研究顯示，對LPS誘導的RAW264.7細胞（有或無LMCNDs處理）進行RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)LPS組和LPS+LMCNDs組基因表達模式存在明顯差異，LPS+LMCNDs組有1229個基因上調(diào)、752個基因下調(diào)（變化倍數(shù)>2，p<0.05）（圖5A）。具體表現(xiàn)為M2型巨噬細胞標志物顯著上調(diào)，M1型標志物水平明顯下降。LPS+LMCNDs組中抗氧化通路顯著增強（圖5B），提示LMCNDs的免疫調(diào)節(jié)效應可能源于抗氧化相關(guān)基因的上調(diào)。圖5C列出了抗氧化通路中的特定基因，其中一些富集基因是NRF2的下游靶標。NRF2對抵御氧化/外來物質(zhì)應激至關(guān)重要，可緩解炎癥。PPI分析發(fā)現(xiàn)35個基因中有15個與NRF2相互作用（圖5D），推測LMCNDs通過激活NRF2觸發(fā)抗氧化進程，重新編程M1/M2巨噬細胞比例。免疫熒光染色和共定位分析顯示，添加LMCNDs后，巨噬細胞中NRF2的核信號明顯增加（圖5E），且隨孵育時間延長，NRF2核水平上升，細胞質(zhì)中NRF2水平下降（圖5F）。用NRF2抑制劑ML385阻斷NRF2激活后，LMCNDs誘導的抗氧化蛋白HO-1上調(diào)顯著受阻（圖5G）。在LPS刺激下，無論是否存在LMCNDs，巨噬細胞中ROS水平失控（圖5H），導致巨噬細胞M2轉(zhuǎn)化受阻（圖5I）。綜上，LMCNDs通過觸發(fā)NRF2核轉(zhuǎn)位對抗氧化應激，規(guī)范感染微環(huán)境，助力巨噬細胞從M1向M2轉(zhuǎn)化。

圖5 LMCNDs介導巨噬細胞極化的機制。（a）展示LPS+LMCNDs組與LPS組之間差異基因的火山圖；（b）KEGG通路分析顯示LPS+LMCNDs組中富集的前15條通路；（c）KEGG通路分析顯示與富集通路相關(guān)的上調(diào)基因，部分NRF2下游靶標基因以紅色突出顯示；（d）與抗氧化途徑相關(guān)的基因的蛋白-蛋白相互作用分析；（e）免疫熒光染色及共定位分析顯示不同處理后巨噬細胞中NRF2與細胞核的共定位；（f）細胞分級實驗及西方印跡確定NRF2的亞細胞定位；（g）加入NRF2抑制劑ML385后，HO-1蛋白水平變化；（h）不同處理組巨噬細胞內(nèi)ROS水平；（i）不同條件下巨噬細胞極化誘導情況

（5）LMCNDs 在小鼠牙周炎模型中的治療效果

小鼠在放置圍繞上頜第二磨牙的細菌斑塊保留結(jié)扎線前進行了7天的適應，并待其患上牙周炎（圖6A）。隨后每只小鼠每2天分別接受一次PBS（對照組）、acLMMs（acLMMs組）或LMCNDs的局部注射，持續(xù)2周，第14天收集樣本進行放射學和組織學分析。研究人員收集心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟進行蘇木精-伊紅（H&E）染色，未觀察到acLMMs或LMCNDs處理的小鼠有明顯形態(tài)變化或炎癥反應，表明納米誘餌具有可接受的生物安全性。結(jié)扎模型中觀察到顯著的水平向牙槽骨吸收，表現(xiàn)為骨體積減少和CEJ?ABC距離增加。與對照組相比，acLMMs組骨丟失部分減少，但牙槽骨高度仍位于牙根的尖部三分之一處。LMCNDs組顯示出最顯著的骨再生，挽救了頰側(cè)或腭側(cè)的骨丟失，牙槽骨高度恢復到根分叉水平（圖6B、圖6C）。H&E和Masson三色染色顯示，對照組中牙周炎導致大量牙槽骨吸收和纖維變形降解，牙周韌帶排列稀疏紊亂；而生物材料治療的小鼠牙周組織恢復，LMCNDs組表現(xiàn)出最強的骨再生，牙根與牙槽骨之間通過緊密、有組織的牙周韌帶建立連接（圖6D）。免疫熒光染色顯示，對照組小鼠中iNOS+細胞顯著積累，acLMMs給藥輕微降低M1與M2比例，而LMCNDs進一步扭轉(zhuǎn)巨噬細胞和炎癥的惡性循環(huán)，使平衡向促進修復的表型傾斜（圖6E）。LMCNDs的免疫調(diào)節(jié)和ROS清除效應重塑牙周袋中的炎癥微環(huán)境，治療后牙周微環(huán)境中的主要促炎因子表達下降，且LMCNDs組中明顯的ALP陽性信號表明牙周硬組織的再生。這些結(jié)果證明LMCNDs具有顯著的免疫調(diào)節(jié)能力，可促進牙周組織再生。

圖6 LMCNDs在小鼠牙周炎模型中的治療效果。（a）建立小鼠牙周炎模型及治療流程示意圖；（b）各組小鼠牙槽骨再生情況的定量分析；（c）通過微CT掃描觀察小鼠牙槽骨情況；（d）收集樣本的H&E和Masson三色染色，箭頭指示CEJ?ABC距離；（e）牙周組織的多重免疫熒光染色