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針對上述問題，復(fù)旦大學(xué)孫濤和蔣晨團(tuán)隊研究團(tuán)隊設(shè)計了一種基于工程化細(xì)菌外膜囊泡（OMVs）的納米平臺（AO@PTP/47aD），用于聯(lián)合遞送阿霉素（DOX）和CD47小干擾RNA（siCd47）。這種納米平臺的設(shè)計思路如下：1核心設(shè)計：陽離子聚合物復(fù)合物（PTP/47aD）-PTP（PEG3.5k-TK-PEI1.8k）：一種低分子量的聚乙二醇（PEG）和聚乙烯亞胺（PEI）的復(fù)合物，通過活性氧（ROS）響應(yīng)性連接子（TK-COOH）連接。這種設(shè)計使得聚合物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高濃度ROS環(huán)境下能夠降解，釋放藥物。siCd47和DOX：通過靜電作用，PTP與siCd47和DOX負(fù)載的核酸適配體結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。2?外層設(shè)計：工程化OMVs（ΔmsbBOMVs）OMVs來源：通過基因工程敲除大腸桿菌（E.coliBL21）的msbB基因，減少OMVs中的內(nèi)毒素含量，提高安全性。功能：OMVs能夠穿透血腦屏障（BBB），并激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗腫瘤效果。3?靶向修飾：Angiopep-2靶向肽：Angiopep-2能夠特異性結(jié)合腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（LRP1），幫助納米平臺穿越BBB并靶向GBM細(xì)胞。該文章于2025年3月4日以《Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles-Based Doxorubicin and CD47-siRNA Co-Delivery Nanoplatform Overcomes Immune Resistance to Potentiate the Immunotherapy of Glioblastoma》為題發(fā)表于《Advanced Materials》（DOI：10.1002/adma.202418053）。

研究示意圖

(1) 納米平臺的制備和表征

納米平臺AO@PTP/47aD的制備（圖2a）及各組分完成表征，包括aptamer負(fù)載阿霉素（DOX）（圖2b）及響應(yīng)ATP釋放DOX（圖2c）。PAP在相同質(zhì)量比下與PTP結(jié)果一致，二者均成功與siCd47和aD共負(fù)載（圖2d）。PTP/47aD與1 mM H?O?共孵育時粒徑顯著增加并持續(xù)24小時，而與0.1 mM H?O?共孵育時幾乎無變化（圖2e）。ΔmsbBOMV經(jīng)檢測內(nèi)毒素水平顯著降低（圖2f），安全性增強(qiáng)。通過超聲及共孵育等操作獲得共遞送納米平臺AO@PTP/47aD，其直徑和zeta電位與O@PTP/47aD無顯著差異（圖2h，i）。形態(tài)學(xué)觀察顯示PTP/47aD為完整球形顆粒，ΔmsbBOMV為經(jīng)典碗狀雙層結(jié)構(gòu)，AO@PTP/47aD為核殼結(jié)構(gòu)，其大小與DLS結(jié)果一致（圖1j）。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）顯示ΔmsbBOMV的紅色熒光與siRNA的綠色熒光高度共定位（圖1k），證實其成功封裝PTP/47aD，與透射電子顯微鏡（TEM）和DLS結(jié)果一致。

圖1 納米體系的制備與表征。a）AO@PTP/47aD的制備的示意圖。B，c）通過ATP適體負(fù)載DOX（b）和通過aD響應(yīng)ATP釋放DOX（c）熒光分光光度法分析。d）通過PTP或PAP共壓縮siCd47和aD的瓊脂糖凝膠電泳分析。（e）PTP/47aD細(xì)胞ROS反應(yīng)性的DLS分析。f）ΔmsbBOMV和野生型OMV的內(nèi)毒素含量分析。g）ΔmsbBOMV與PTP/47aD比例的ζ電位分析。h，i，j）PTP/47、ΔmsbBOMV、O@PTP/47aD和AO@PTP/47aD的尺寸（h）和ζ電位（i）的半定量結(jié)果（j）的TEM圖像。比例尺=50nm（左右）。比例尺=100nm（中間）。k）ΔmsbBOMV和siRNA之間共定位的代表性共聚焦圖像。用Dil標(biāo)記的ΔmsbBOMV：紅色。用FAM標(biāo)記的siRNA：綠色。比例尺=10μm

（2）納米平臺誘導(dǎo)的毒性和ICD

鑒于SiRNA和DOX在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，研究了納米平臺在細(xì)胞水平上的攝取行為。結(jié)果顯示，G422細(xì)胞對AO@PTP/47aD的攝取主要通過能量依賴性機(jī)制和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用發(fā)生（圖3a，b），表明納米平臺經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)溶酶體途徑。CCK8實驗表明，DOX（447.2 nM）和AO@PAP/47aD（494.5 nM）具有相似的半最大抑制濃度，而AO@PTP/47aD的IC50降低至285.5 nM（圖3c）。7-AAD/AnnexinV染色（圖3d）觀察細(xì)胞凋亡情況，AO@PTP/47aD對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生實質(zhì)性細(xì)胞毒性作用。接下來，評估了AO@PTP/47aD誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）的能力。如圖3e-g所示，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和Western Blot（WB）分析表明，所有含DOX的制劑都引起可測量的ICD反應(yīng)。與ROS非應(yīng)答制劑和缺乏血管肽素-2修飾的制劑相比，AO@PTP/47aD引起最強(qiáng)的CRT暴露并顯著促進(jìn)HMGB1核轉(zhuǎn)位。免疫熒光（IF）結(jié)果進(jìn)一步證實了這些發(fā)現(xiàn)（圖3h）。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析顯示，AO@PTP/47aD組中成熟樹突狀細(xì)胞（DC）的比例最高（圖3j），這與觀察到的CRT暴露和HMGB1核轉(zhuǎn)位的程度一致，從而為后續(xù)T細(xì)胞活化奠定了基礎(chǔ)。

圖2 納米平臺誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和ICD。a，b）AO@PTP/47aD攝取途徑的FCM分析（a）和相應(yīng)的半定量結(jié)果（b）熒光依賴性攝取。c）不同制劑的細(xì)胞毒性分析。。d）不同制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的FCM分析。e，f）不同制劑誘導(dǎo)的CRT表達(dá)的FCM分析（e）和相應(yīng)的半定量結(jié)果（f）。g）不同處理后細(xì)胞質(zhì)HMGB1和核HMGB1表達(dá)的WB分析。h，i）不同處理后CRT表達(dá)（h）和HMGB1核共定位（i）的代表性共聚焦圖像。比例尺=20μm。j）FCM分析通過不同配方促進(jìn)BMDC的成熟

（3）納米平臺促進(jìn)的GAM的吞噬作用

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）適應(yīng)性免疫抗性的主要特征是腫瘤細(xì)胞通過過表達(dá)多種檢查點來逃避免疫細(xì)胞的攻擊和破壞。在腫瘤微環(huán)境（TME）中，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（GAM）是主要的免疫細(xì)胞，CD47介導(dǎo)的吞噬逃逸起著重要作用。對患者來源的GBM組織進(jìn)行Western Blot（WB）和免疫熒光（IF）分析進(jìn)一步確認(rèn)了這一點。這些結(jié)果提示，利用siRNA下調(diào)GBM細(xì)胞表面CD47的表達(dá)，可有效降低GBM細(xì)胞的吞噬逃逸能力，從而增強(qiáng)GAM對GBM的吞噬作用，克服GBM細(xì)胞的獲得性免疫抵抗。

通過免疫熒光（IF）觀察到，移植G422細(xì)胞的原位GBM荷瘤小鼠切片中，GBM區(qū)域的CD47熒光信號顯著強(qiáng)于周圍瘤周組織和相應(yīng)的正常腦組織中的CD47熒光信號（圖4b）。與先前的siCd47篩選一致，Western Blot（WB）和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析顯示，含有siCd47的制劑在不同程度上降低了G422細(xì)胞中的CD47表達(dá)水平。值得注意的是，在PTP/47a條件下，ROS響應(yīng)性和Angiopep-2修飾的AO的沉默效應(yīng)最為顯著（圖4c-e）。

此外，為了驗證CD47敲低產(chǎn)生的促吞噬作用，從C57BL/6小鼠中提取骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDM），并選擇BV2細(xì)胞代表GAM。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)AO@PTP/47a處理后，BV2細(xì)胞對G422細(xì)胞的吞噬能力提高了約1.6倍，超過了商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑siRNA-Mate的效果（圖4g，h）。

圖3 Nanoplatform敲低CD47以促進(jìn)GAMs的吞噬作用。a，b）來自GBM患者（a）和攜帶原位GBM的小鼠（b）的瘤周組織和GBM組織之間CD47表達(dá)的代表性免疫熒光圖像。比例尺=200μm。c，d）不同制劑誘導(dǎo)的CD47敲低的WB分析和相應(yīng)的半定量結(jié)果。e）不同制劑誘導(dǎo)的CD47敲低的FCM分析。f）基于ΔmsbBOMVs的納米平臺促進(jìn)GAMs吞噬過程的示意圖。g，h）不同處理后BV2細(xì)胞吞噬作用的FCM分析和相應(yīng)的半定量結(jié)果

（4）納米平臺對GAMS的重編程

盡管ΔmsbBOMV的內(nèi)毒素含量顯著降低，但作為細(xì)菌源性物質(zhì)，它們?nèi)钥赏ㄟ^病原體相關(guān)分子模式激活免疫系統(tǒng)。此前的研究已證實ΔmsbBOMV可使巨噬細(xì)胞恢復(fù)?；诖?，研究了AO@PTP/47aD是否能逆轉(zhuǎn)GAM的表型，以進(jìn)一步克服GBM的適應(yīng)性免疫抗性（圖5a）。結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)ΔmsbBOMV和AO@PTP/47aD處理24小時后，M2樣BV2細(xì)胞和M2樣BMDM的比例降低，而M1樣BV2細(xì)胞和M1樣BMDM的比例顯著增加（圖5b）。

為探究ΔmsbBOMV啟動GAM重編程的潛在機(jī)制，重點關(guān)注經(jīng)典的NF-κB通路。Western Blot（WB）分析顯示，與對照組和IL-4處理組相比，經(jīng)LPS和IFN-γ組合處理以及ΔmsbBOMV和AO@PTP/47aD處理的BV2細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)中p65水平降低和細(xì)胞核中p65水平增加（圖5d-f）。這一結(jié)果證實了NF-κB通路的激活。

圖4 通過納米平臺重編程GAM。a）AO@PTP/47aD重編程GAM的示意圖。b）不同處理后BV2細(xì)胞和BMDMs重編程的FCM分析。c）AO@PTP/47aD重編程BV2細(xì)胞的機(jī)制示意圖。d-f）不同處理后BV2細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)p65和核p65表達(dá)的WB分析（d）和相應(yīng)的半定量結(jié)果（e，f）

（5）納米平臺的穿透BBB和GBM靶向能力

首先通過Western Blot（WB）證實LRP1在GBM細(xì)胞（G422和GL261）和腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCEC）中高度表達(dá)（圖6a），這為基于Angiopep-2的共遞送系統(tǒng)在體內(nèi)穿過血腦屏障（BBB）和靶向GBM提供了基礎(chǔ)。隨后，使用Transwell構(gòu)建體外BBB模型，評價其穿過BBB的能力（圖6b）。結(jié)果表明，AO@PTP/47aD進(jìn)入下室的滲透是O@PTP/47aD的1.75倍，而游離Angiopep-2的額外存在降低了其BBB滲透能力（圖6c）。

隨后，進(jìn)一步探索了其體內(nèi)靶向GBM的能力。從體內(nèi)腦內(nèi)信號變化的角度來看，從尾靜脈注射后1小時開始，AO@PTP/47aD在腦內(nèi)的蓄積明顯高于O@PTP/47aD。該差異在注射后8小時進(jìn)一步增加，并持續(xù)至注射后24小時（圖6d、e），提示AO@PTP/47aD具有較強(qiáng)的腦靶向性。離體器官成像結(jié)果顯示，與非靶向組相比，靶向組在腦中的蓄積更多，而在肝臟和肺中的蓄積較少（圖6f，g）。因此，Angiopep-2的修飾不僅增強(qiáng)了納米平臺的腦靶向能力，還減少了其在肝臟和肺部的積累，從而最大限度地減少了非特異性分布并減少了脫靶效應(yīng)。

圖5 納米平臺穿透BBB并靶向GBM的能力。a）BCECs、G422、GL261和HEK293細(xì)胞中LRP1表達(dá)的WB分析。b）AO@PTP/47aD穿過體外BBB模型的示意圖。c）分析不同制劑在穿越體外BBB中的滲透量隨時間的變化。數(shù)據(jù)以SD±平均值表示（n=3個獨立實驗）。d，e）AO@PTP/47aD和O@PTP/47aD在不同時間在GBM原位小鼠大腦中積累的代表性IVIS圖像和相應(yīng)的半定量結(jié)果。f，g）尾靜脈注射后24hAO@PTP/47aD和O@PTP/47aD在主要器官中積累的代表性IVIS圖像和相應(yīng)的半定量結(jié)果。h）尾靜脈注射后24小時血管標(biāo)志物CD31和納米平臺在GBM病變區(qū)域分布的免疫熒光成像結(jié)果（局部區(qū)域）。比例尺=100μm。i）CD31和納米平臺在非靶向組和靶向組中的共定位分析

（6）納米平臺的體內(nèi)抗腫瘤作用

在使用G422-熒光素酶（G422-Luci）構(gòu)建的C57BL/6原位GBM小鼠模型中探索AO@PTP/47aD的體內(nèi)抗腫瘤作用。在整個治療過程中記錄小鼠的存活率和體重。如圖7b所示，與生理鹽水和游離DOX組相比，AO@PTP/47a表現(xiàn)出較弱的腫瘤生長抑制，表明單獨調(diào)節(jié)GAMs在GBM中產(chǎn)生的抗腫瘤作用有限。AO@PTP/SaD顯示出一定程度的腫瘤生長抑制，初步表明解決GBM中內(nèi)在免疫抵抗和適應(yīng)性免疫抵抗的策略是有效的。此外，在治療期間，所有小鼠組均表現(xiàn)出體重下降，這可能是由于惡性腦腫瘤的快速增殖。然而，AO@PTP/47aD治療組的體重減輕有所緩解（圖7c）。就存活率而言（圖7d），AO@PTP/47a組的中位生存時間為18天，與生理鹽水組（15天）相比，未顯示出顯著的生存獲益。隨后，我們使用免疫組織化學(xué)研究了不同治療組腫瘤細(xì)胞中TUNEL表達(dá)。結(jié)果表明，AO@PTP/47aD組TUNEL的凋亡信號在對照組中最強(qiáng)（圖7e），表明該組中的腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷了最有效的殺傷。

圖6 納米平臺的體內(nèi)抗腫瘤作用。a）原位GBM荷瘤小鼠給藥組和方案示意圖。b-d）接受指定治療的原位GBM荷瘤小鼠的平均腫瘤信號生長曲線（b）、體重變化（c）和動物存活率（d）。e）每組中TUNEL表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。比例尺=50μm

（7）納米平臺的體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)

基于AO@PTP/47aD在體內(nèi)優(yōu)異的抗腫瘤結(jié)果，在體內(nèi)評估了免疫激活。給藥四次后，處死小鼠，解剖和處理其腦組織以制備單細(xì)胞懸液。使用Percoll細(xì)胞分離溶液和離心，獲得富含腦免疫細(xì)胞的環(huán)層，并通過FCM對免疫細(xì)胞進(jìn)行染色和分析，以評估GBM免疫微環(huán)境的整體變化（圖8a）。定量FCM結(jié)果（圖8b-f）顯示，AO@PTP/47aD處理后，荷瘤小鼠GBM病灶中成熟DC（CD80CD86）、CD8T細(xì)胞（CD3CD8）和M1樣GAMs（F4/80CD86）的比例顯著增加，而M2樣GAMs（F4/80CD206）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs，CD25Foxp3）的比例顯著降低。這表明GBM中免疫抑制微環(huán)境的廣泛逆轉(zhuǎn)。隨后，使用IF可視化GBM病變部位免疫細(xì)胞的分布。與FCM結(jié)果一致，G6組CD8T細(xì)胞和M1樣GAMs的浸潤水平顯著高于其他對照組，而M2樣GAMs和Foxp3Tregs在切片水平上幾乎檢測不到（圖8g-n）。此外，值得注意的是，在G6組中也發(fā)現(xiàn)了高水平的顆粒酶B（GZBM），表明AO@PTP/47aD不僅改善了CD8T細(xì)胞的浸潤，還增強(qiáng)了其活性，以確保其有效的腫瘤殺傷功能（圖8o，p）。ELISA來評估GBM部位相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。治療后，G6組誘導(dǎo)的IFN-γ、TNF-α和IL-12水平最高，與CD8T細(xì)胞和M1樣GAMs的抗腫瘤功能密切相關(guān)。相比之下，與M2樣GAMs的促腫瘤功能和維持微環(huán)境免疫抑制特性相關(guān)IL-10和TGF-β的水平最低（圖8q-u）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了AO@PTP/47aD全面徹底地激活了大腦中的抗腫瘤免疫反應(yīng)，將GBM從“冷”腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁帷蹦[瘤。

圖7 抗腫瘤免疫反應(yīng)的評估。a）攜帶原位GBM的C57BL/6小鼠腦組織FCM分析示意圖。b-f）荷瘤小鼠大腦中成熟DC（b）、CD8T細(xì)胞（c）、M1樣GAMs（d）、M2樣GAMs（e）和Tregs（f）比例的半定量結(jié)果。g、h）5次處理后GBM區(qū)域CD8T細(xì)胞浸潤程度的代表性IF圖像（g）和相應(yīng)的半定量結(jié)果（h）。比例尺=50μm。i，j）代表性IF圖像經(jīng)過5次處理后M1樣GAMs浸潤在GBM區(qū)域的程度和相應(yīng)的半定量結(jié)果。k，l）五次處理后GBM區(qū)域M2樣GAMs浸潤程度的代表性IF圖像和相應(yīng)的半定量結(jié)果。比例尺=50μm。m，n）五次處理后GBM區(qū)域Foxp3Tregs浸潤程度的代表性IF圖像和相應(yīng)的半定量結(jié)果。比例尺=50μm。o，p）五次處理后GBM區(qū)域顆粒酶B表達(dá)的代表性IF圖像和相應(yīng)的半定量結(jié)果。比例尺=50μm。。q-u）五次治療后腫瘤問題中IFN-γ（q）、TNF-α（r）、IL-12p70（s）、IL-10（t）和TGF-β（u）含量的半定量結(jié)果

（8）體內(nèi)抗腫瘤作用和免疫反應(yīng)的機(jī)制

AO@PTP/47aD旨在全面破壞GBM的免疫抵抗并增強(qiáng)免疫治療的療效。一方面，它通過誘導(dǎo)ICD克服內(nèi)在免疫抵抗來增強(qiáng)GBM的免疫原性，從而促進(jìn)DC成熟和T細(xì)胞活化。另一方面，它利用siCd47和ΔmsbBOMV精確沉默CD47并重編程GAM，從而克服適應(yīng)性免疫抵抗，從而增強(qiáng)GAMs對GBM的吞噬能力，使它們分泌大量促炎細(xì)胞因子殺死腫瘤細(xì)胞（圖9a）。因此，這種策略的協(xié)同效應(yīng)可能產(chǎn)生出色的抗腫瘤和免疫激活能力，促使我們驗證潛在的機(jī)制。給藥五次后，處死小鼠，收集腦組織制備組織切片和勻漿。首先，使用IF檢查腫瘤組織中CRT的表達(dá)。值得注意的是，與其他對照組相比，在用AO@PTP/47aD治療的腫瘤核心區(qū)域觀察到強(qiáng)烈而集中的CRT熒光信號（圖9b，c），表明GBM的內(nèi)在免疫抵抗被有效克服。同時，組織WB分析顯示AO@PTP/47aD處理組的CRT和HMGB1表達(dá)水平最高（圖9d-f），進(jìn)一步證實了這一結(jié)論。隨后，為評價各治療組GBM的適應(yīng)性免疫抵抗能力，使用組織WB定量腫瘤中GAMs表型標(biāo)志物和CD47的表達(dá)。如圖9g，h所示，與生理鹽水組相比，游離DOX處理后GBM中的CD47水平有所增加。這可能歸因于響應(yīng)化療引發(fā)的免疫效應(yīng)而上調(diào)的特異性免疫檢查點。相比之下，其他治療組的CD47表達(dá)顯著降低，表明GBM的適應(yīng)性免疫抵抗被破壞。與CD47表達(dá)的變化不同，與G4相比，在G5和G6中觀察到M1樣GAM標(biāo)志物（CD86和CD16）的增加更明顯，而M2樣GAM標(biāo)志物（CD206和Arg-1）的減少更顯著（圖9i-l）。這表明，通過克服GBM的內(nèi)在免疫抵抗，可以進(jìn)一步破壞適應(yīng)性免疫抵抗。綜上所述，這些結(jié)果表明，基于ΔmsbBOMV的納米平臺AO@PTP/47aD通過同時克服GBM中的內(nèi)在免疫耐藥性和適應(yīng)性免疫耐藥性，引發(fā)了強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖8 體內(nèi)抗腫瘤作用和免疫反應(yīng)激活的機(jī)制。a）AO@PTP/47aD克服GBM和適應(yīng)性免疫抵抗的示意圖。b，c）5次處理后GBM區(qū)域CRT表達(dá)的代表性IF圖像和相應(yīng)的半定量結(jié)果。比例尺=100μm。。d）5次治療后腫瘤組織中CRT和HMGB1表達(dá)的WB分析。e，f）5次治療后腫瘤組織中CRT（e）和HMGB1（f）表達(dá)的半定量結(jié)果。g，h）WB分析治療5次后腫瘤組織中CD47表達(dá)的相應(yīng)半定量結(jié)果。i）5次治療后腫瘤組織中CD206、Arg-1、CD86和CD16表達(dá)的WB分析。j-l）5次治療后腫瘤組織中CD86（j）、Arg-1（k）和CD206（l）表達(dá)的半定量結(jié)果