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為了解決這些問題，南昌大學王小磊團隊開發(fā)了一種受冷啤酒啟發(fā)的多功能納米酶（CMPd(H)U），旨在實現(xiàn)快速血栓清除和持久的氫氣療法，以改善缺血性中風的治療效果。CMPd(H)U有效靶向血栓，并結(jié)合氣體療法加速溶栓并恢復血流。此外，CMPd（H）U釋放H2以消除ROS，從而減輕再灌注損傷。此外，CMPd（H）U通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞對M2表型的極化和抑制神經(jīng)元焦亡表現(xiàn)出抗炎和神經(jīng)保護特性。動物行為實驗證實了該系統(tǒng)在促進中風后神經(jīng)運動功能恢復方面的有效性。該文章于2025年1月11日以《Cold beer-inspired multifunctional nanozyme for ischemic stroke with rapid thrombus clearance and long-lasting hydrogen therapy》為題發(fā)表于《Nano Today》（doi:10.1016/j.nantod.2025.102636）

圖1 CMPd(H)U納米酶的合成及其在缺血性卒中快速血栓清除和長效H2治療中的應用

（1）CMPd(H)U納米酶的合成與表征

圖2a所示，SEM圖像可以看到MOF、MPd、CMPd的表面含有大量均勻的開放孔隙。TEM和AFM圖像證明CMPd(H)U納米酶內(nèi)部的介孔結(jié)構(gòu)分布均勻（圖2b和c）。EDS圖像顯示鋯、鈀、硫和溴元素的分布（圖2d）。CMPd的氮氣吸附等溫線呈現(xiàn)IV型曲線，表明存在介孔（圖2e），BJH孔徑分布證實了這一結(jié)果（圖2e插圖）。FTIR光譜分析了CMPd(H)U納米酶的官能團變化表明CREKA肽修飾成功（圖2f）。經(jīng)過修飾后各種材料的zeta電位結(jié)果圖（圖2g）。X射線衍射圖譜表明經(jīng)過一系列修飾后，MOF的框架結(jié)構(gòu)仍然得到了很好的保持（圖2h）。X射線光電子能譜分析證實了零價鈀的存在（圖2i）。動態(tài)光散射結(jié)果證明了CMPd(H)U納米酶的良好穩(wěn)定性（圖2j）。上述結(jié)果證明了納米酶的成功制備。

圖2 CMPd(H)U納米酶的特性表征。（a）（a1）MOF、（a2）MPd、（a3）CMPd和（a4）CMPdU的掃描電子顯微鏡圖像；（b）CMPd(H)U的透射電子顯微鏡圖像和（c）原子力顯微鏡圖像；（d）CMPd(H)U中Zr、Pd、S和Br元素的元素分布圖；（e）CMPd和CMPdU的氮氣吸附-脫附等溫線，插圖：相應的BJH孔徑分布；（f）MOF、CMPd和CMPdU的傅里葉變換紅外光譜；（g）MOF、MPd、CMPd和CMPdU的zeta電位；（h）MOF和CMPd(H)U的X射線衍射圖譜；（i）CMPd(H)U中Zr 3p和Pd 3d的高分辨X射線光電子能譜；（j）CMPd(H)U在不同溶液中7天后的流體動力學直徑，數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）

（2）NIR增強的體外H₂釋放和溶栓

首先探索CMPd(H)U納米酶的光熱特性。在NIR照射10分鐘后，CMPd(H)U溶液的溫度大約上升了22.3℃（圖3a）。此外，在開/關(guān)循環(huán)實驗中，CMPd(H)U納米酶仍表現(xiàn)出穩(wěn)定的光熱轉(zhuǎn)換性能（圖3b），表明其具有優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。進一步研究NIR對CMPd(H)U納米酶釋放H₂能力的影響。經(jīng)過CMPd(H)U納米顆粒處理的MB的UV-vis吸收峰顯著降低，并且并NIR將H₂的釋放過程縮短至12小時（圖3c）。研究了CMPd(H)U納米酶在BV2和HT22細胞模型中的細胞內(nèi)H₂釋放情況。在NIR照射下，經(jīng)過CMPd(H)U納米酶處理的BV2呈現(xiàn)出最淺的藍色（圖3d）。在HT22中也觀察到了相同的結(jié)果（圖3e）。這表明NIR刺激下從CMPd(H)U納米酶快速釋放的H₂具有更強的生物還原性。隨后研究了CMPd(H)U納米酶在37℃或NIR照射下的uPA釋放行為。在NIR照射下，uPA的釋放量在37℃時僅為8.51%（圖3f）。從老鼠身上采集新鮮血液，建立體外血栓模型（圖3g）。實驗結(jié)果表明CMPd(H)U + NIR組的溶栓是uPA、光熱和H₂氣泡的協(xié)同作用的結(jié)果（圖3h）。

圖3 近紅外增強的體外釋放行為和溶栓效果。（a）CMPd(H)U在不同濃度下經(jīng)近紅外激光照射的光熱曲線；（b）CMPd(H)U經(jīng)過五次近紅外開關(guān)循環(huán)后的溫度變化；（c）采用MB探針測量H?O和CMPd(H)U的還原性H?釋放行為；使用MB染色的（d）BV2和（e）HT22細胞對CMPd(H)U在有無近紅外激光照射下釋放的還原性H?進行定性調(diào)查；（f）CMPd(H)U在37℃或經(jīng)近紅外激光照射下釋放的uPA；（g）不同處理后血栓的照片（比例尺=1 cm）；（h）殘余血栓重量。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）。**p<0.01, ***p<0.001

（3）體外抗氧化、細胞毒性和BBB通透性

CMPd(H)U納米顆粒的抗氧化能力示意圖如圖4a所示。由于還原性H₂的釋放以及鈀納米顆粒的超氧化物歧化酶樣酶活性，兩種自由基的信號強度顯著降低（圖4b和c）。隨著CMPd(H)U濃度的增加和時間的推移，H₂O₂的分解率增加，表明CMPd(H)U具有類過氧化氫酶活性（圖4d）。當濃度達到100 μg mL?1時，CMPd(H)U能夠清除約60%的DPPH?和75%的ABTS??（圖4e和f）。圖4g和h顯示，與CMPd(H)U共培養(yǎng)3天后，bEnd.3、HUVECs、BV2和HT22的存活率均高于90%。評估CMPd(H)U的BBB穿透能力和腦靶向能力，bEnd.3接種在上室以模擬BBB，BV2或HT22接種在下室作為受體細胞（圖4i）。在不同時間點觀察BV2和HT22的熒光，Cy5-CMPd(H)U的熒光不僅更強，還顯示出更明顯的共定位現(xiàn)象（圖4j），在HT22中也觀察到類似現(xiàn)象（圖4k）。所有這些結(jié)果表明，該納米酶具有良好的BBB穿透能力和對BV2和HT22的靶向能力。因此，CMPd(H)U納米酶有望在腦缺血病變區(qū)域積累。

圖4 CMPd(H)U納米酶的抗氧化活性、細胞活力和細胞攝取行為。（a）CMPd(H)U納米酶清除活性氧（ROS）的機制；（b）羥基自由基（?OH）和（c）超氧陰離子自由基（?O??）清除的電子順磁共振（EPR）光譜；（d）CMPd(H)U納米酶催化產(chǎn)生的溶解氧濃度；（e）DPPH?和（f）ABTS??的清除率，插圖：相應反應的圖像（比例尺=1 cm）；（g）bEnd.3和HUVECs以及（h）BV2和HT22細胞在與不同濃度的CMPd(H)U共培養(yǎng)72小時后的細胞活力；（i）體外血腦屏障模型構(gòu)建的示意圖；（j）BV2和（k）HT22細胞的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像，顯示細胞攝取情況。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns：不顯著

（4）體外抗炎和神經(jīng)保護作用

清除ROS可以有效地促使小膠質(zhì)細胞從M1表型極化為M2表型，從而緩解炎癥微環(huán)境（圖5a）。用DCFH - DA檢測細胞內(nèi)ROS，CMPd(H)U處理顯著降低了細胞內(nèi)ROS水平（圖5b）。通過流式細胞術(shù)檢測CD86（和CD206，以進一步探討不同組對BV2細胞極化的影響（圖5c - f）。此外，CMPd(H)U + NIR組有效減少了TNF-α的分泌，增加了IL-10的分泌（圖5g和h）。上述結(jié)果均表明，CMPd(H)U + NIR組通過快速釋放還原性H₂抑制BV2的M1極化，增加M2極化，有效減少了LPS誘導的BV2細胞炎癥。

圖5 CMPd(H)U的體外活性氧清除和抗炎效果。（a）描述CMPd(H)U調(diào)節(jié)LPS誘導的BV2極化機制的示意圖；（b）LPS（1 μg mL?1）刺激后不同組BV2中活性氧（ROS）的熒光圖像；流式細胞術(shù)及其對應的定量分析顯示，經(jīng)過不同處理后BV2的（c, e）M1和（d, f）M2極化情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測LPS誘導的BV2在不同處理后上清液中的（g）TNF-α和（h）IL-10水平。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

進一步研究CMPd(H)U納米酶對抑制神經(jīng)元焦亡的影響（圖6a）。采用DCFH-DA鑒定細胞內(nèi)ROS，該納米酶表現(xiàn)出令人滿意的抑制過量ROS產(chǎn)生的能力（圖6b）。圖6c所示， CMPd(H)U + NIR組顯示出相對正常的形態(tài)，囊泡數(shù)量顯著減少。進一步的免疫熒光染色分析表明，CMPd(H)U + NIR組可以顯著抑制GSDMD-N的表達（圖6d）。圖6e和f所示，CMPd(H)U + NIR處理逆轉(zhuǎn)了OGD/R刺激的HT22中NLRP3和IL-1β的表達，并顯著下調(diào)了Caspase-1和GSDMD-N蛋白水平。此外，CMPd(H)U + NIR的干預將OGD/R刺激的HT22上清液中IL-1β的濃度降低了約三分之二（圖6g）。總之，這些結(jié)果強有力地表明，CMPd(H)U + NIR通過快速清除ROS抑制了NLRP3炎癥體激活介導的神經(jīng)元焦亡，表明其對CIRI具有良好的治療效果。

圖6 CMPd(H)U的體外活性氧清除和抗焦亡能力。（a）描述CMPd(H)U抑制OGD/R誘導的HT22焦亡機制的示意圖；（b）OGD/R刺激后不同組HT22中活性氧（ROS）的熒光圖像；（c）HT22的代表性明場顯微鏡圖像，箭頭指示焦亡細胞；（d）經(jīng)處理后OGD/R刺激的HT22中GSDMD-N的免疫熒光染色圖像；（e）西方印跡（WB）圖像和（f）定量結(jié)果顯示不同處理下HT22蛋白裂解液中NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β水平，β-actin作為加載對照；（g）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測不同處理后HT22上清液中的IL-1β水平。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns：不顯著

（5）體內(nèi)治療效果

我們利用RB染料和532 nm綠色激光構(gòu)建了小鼠PT缺血性中風模型，以評估納米酶的體內(nèi)治療效果（圖7a）。小鼠在預設(shè)時間點被安樂死，收集大腦進行離體熒光成像。CMPd(H)U納米酶可以快速靶向腦缺血部位的血栓（圖7b和c）。圖6d所示，Cy5 - CMPd(H)U的紅色熒光與纖維蛋白的黃色熒光的重疊強度最高，表明納米酶可以準確靶向血栓。通過LSI在給藥前后不同時間點對小鼠進行rCBF成像，并根據(jù)rCBF的恢復評估其體內(nèi)的溶栓效果（圖7e）。與其他組相比，CMPd(H)U + NIR組在給藥后2小時或6小時顯示出最佳的血流恢復（圖7f和g）。納米酶由于其出色的血栓靶向能力結(jié)合NIR刺激的uPA和快速釋放的H₂，可以增強溶栓效果。

圖7 CMPd(H)U的體內(nèi)靶向溶栓效果。（a）激光散斑成像（LSI）和活體成像系統(tǒng)（IVIS）的時間安排；（b）腦組織的離體熒光圖像和（c）相應的定量分析；（d）血栓形成和CMPd(H)U靶向血栓能力的免疫染色（藍色：DAPI；綠色：CD31用于標記血管；黃色：纖維蛋白用于標記血栓；紅色：標記有Cy5的MPd(H)U和CMPd(H)U）；（e）小鼠在缺血前（基線）、缺血期間（PT）以及不同處理后的代表性激光散斑圖像，以及（f?g）平均血流的定量分析。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns：不顯著

進一步探索CMPd(H)U納米酶的體內(nèi)治療效果（圖8a）。用TTC溶液對腦切片進行染色，定量評估CMPd(H)U的腦保護效果（圖8b），CMPd(H) + NIR組的梗死面積略有減少（約5.1 mm³）（圖8c）。H&E染色的病理檢查結(jié)果表明，CMPd(H)U + NIR減少了壞死區(qū)域的面積，而沒有對腦組織造成損傷（圖8d）。免疫熒光檢測結(jié)果表明，在PT中風損傷組織邊緣Iba-1高表達，表明小膠質(zhì)細胞在缺血半暗帶被激活（圖8e和f）。隨后通過NeuN/GSDMD-N研究了溶栓和再灌注后神經(jīng)元的焦亡情況（圖8g），CMPd(H)U + NIR治療可以最大限度地減少GSDMD-N的表達，證明抑制了神經(jīng)元焦亡。上述結(jié)果表明，NIR增強的快速溶栓結(jié)合持續(xù)的H?治療是減輕腦梗死的有效策略。

圖8 CMPd(H)U在缺血性中風小鼠中的治療效果。（a）治療評估的時間安排；（b）TTC染色腦切片的代表性圖像和（c）梗死體積的定量分析，右側(cè)大腦半球的白色區(qū)域（黃色圓圈）代表梗死區(qū)域；（d）H&E染色腦切片的代表性圖像；（e）在損傷部位周圍CD86（M1標記物，綠色）和（f）CD206（M2標記物，綠色）的免疫熒光染色圖像，Iba-1（小膠質(zhì)細胞標記物）染成紅色，細胞核染成藍色；（g）在損傷部位周圍NeuN（紅色）和GSDMD-N（綠色）的免疫熒光染色圖像，細胞核染成藍色，每張圖像的上下部分分別為邊界組織和正常組織。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥3）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

（6）神經(jīng)運動功能評估

在治療后不同時間點進行了包括曠場實驗、旋轉(zhuǎn)桿實驗和圓柱實驗的行為測試（圖9a）。圖9b-f所示，治療后第三天，小鼠變得更加活躍，表明其運動能力得到恢復。CMPd(H)U + NIR治療后，小鼠的運動協(xié)調(diào)能力顯著提高，這些小鼠能夠在旋轉(zhuǎn)桿上停留更長時間（圖9g和h）。圖9i和j所示，經(jīng)過CMPd(H)U + NIR治療的PT小鼠在治療7天后，在圓柱實驗中前肢不對稱性得分顯著低于其他組。上述結(jié)果表明，CMPd(H)U納米酶結(jié)合NIR治療有助于中風后神經(jīng)功能的康復。

圖9 CMPd(H)U治療后中風后的神經(jīng)運動功能恢復。（a）行為測試時間線的示意圖；（b）開放場測試的示意圖；（c）運動距離，（d）穿越格子的次數(shù)，（e）休息時間，以及（f）不同組小鼠在開放場測試中的運動軌跡圖；（g）旋轉(zhuǎn)桿測試的示意圖，以及（h）跌落潛伏期；（i）圓柱體測試的示意圖，以及（j）前肢使用不對稱評分。數(shù)據(jù)為平均值±標準差（n≥8）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns：不顯著