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急性肺損傷（ALI）及其更為嚴重的形式急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種與M1/M2巨噬細胞極化失衡密切相關的危及生命的疾病?，F(xiàn)有治療策略因副作用、給藥途徑受限及靶向性差而存在諸多爭議，限制了其臨床應用。近年來，草藥醫(yī)學的發(fā)展揭示了許多具有抗炎作用的化合物，這些化合物有望應用于ALI的治療。其中，佛柑內酯（bergapten）是一種從無花果屬（Ficus simplicissima Lour.）中分離出來的補骨脂素類化合物，盡管它主要被用于抗癌治療，但其對ALI的潛在療效仍未被探索。由于bergapten的低溶解性和不良體內分布，大大限制了其應用潛力，因此，迫切需要開發(fā)一種能夠提高bergapten靶向性和療效的遞送系統(tǒng)，用于ALI的治療。

針對上述問題，廣州中醫(yī)藥大學張忠德團隊開發(fā)了一種具有生物活性且靶向肺部的脂質納米藥物，命名為Ber-lipo，該納米藥物將bergapten與二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）脂質體結合。DPPC是肺表面活性劑的主要成分，具有幫助藥物遞送至肺部的作用。Ber-lipo在體外和體內均顯示出良好的穩(wěn)定性、生物分布和生物相容性，并顯著改善了小鼠ALI表型，包括肺水腫、促炎狀態(tài)、肺損傷、肺功能障礙和肺通透性。此外，Ber-lipo通過減少促炎的M1型巨噬細胞并增加抗炎的M2型巨噬細胞，維持了巨噬細胞極化的平衡。機制上，Ber-lipo抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活?？傊撗芯渴状巫C明了Ber-lipo通過調節(jié)巨噬細胞極化，緩解ALI癥狀，為臨床ALI治療提供了一種有前景的策略。相關研究在2024年10月1日以“Inhalable and bioactive lipid-nanomedicine based on bergapten for targeted acute lung injury therapy via orchestrating macrophage polarization”為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.09.020）上。

圖1 開發(fā)具有生物活性且具有肺靶向性的Ber-lipo，通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路的激活來維持巨噬細胞極化的穩(wěn)態(tài)，從而增強小鼠 ALI 治療

（1） Ber-lipo的合成及表征

本研究通過多項實驗驗證了Ber-lipo的物理化學性質和治療效果。透射電子顯微鏡（圖2A）顯示，Lipo和Ber-lipo均呈均一球形，直徑約為115 nm，動態(tài)光散射（圖2B）進一步證實了Lipo和Ber-lipo的平均粒徑分別為111.2 nm和116.1 nm。電泳光散射（圖2C）顯示其zeta電位分別為-9 mV和-7 mV，表明bergapten與Lipo具有良好的電荷相容性。粒徑和多分散指數(shù)的7天監(jiān)測結果（圖2D-E）顯示其在水中保持良好穩(wěn)定性。細胞實驗中，Dil標記的Lipo在RAW264.7細胞中分布均勻，且LPS刺激無顯著影響（圖2F）。在急性肺損傷（ALI）小鼠模型中，IVIS成像（圖2G-K）表明，Dir標記的Lipo在肺部的積累隨時間增加，且在血液中具有良好穩(wěn)定性（圖2L）。這些結果共同證明了Ber-lipo在ALI治療中的潛力。

圖2 Ber-lipo 的特性。（A）使用 TEM 可視化的 Lipo 和 Ber-lipo 的形態(tài)。（B）通過動態(tài)光散射法分析 Lipo 和 Ber-lipo 的尺寸分布。（C）通過電泳光散射法測試室溫下在水中稀釋的 Lipo 和 Ber-lipo 的表面 zeta 電位。（D）在水中儲存 7 天后 Lipo 和 Ber-lipo 的尺寸穩(wěn)定性。（E）連續(xù) 7 天內 Lipo 和 Ber-lipo 在水中的多分散指數(shù)。（F）用共聚焦顯微鏡成像的 Dil/Dil@lipo 在有或沒有 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞中的生物分布。 (G) IVIS 下觀察到Dir/Dir@lipo 在 ALI 小鼠體內的生物分布示意圖。 (H–L)：(H)通過 IVIS 成像觀察腹膜內注射 Dir@lipo 和 Dir 后不同時間段在主要器官中的體內生物分布。 (I) 各組肺與肝熒光強度比的統(tǒng)計分析。 (J–L) 肝臟、肺和血液中熒光強度的統(tǒng)計分析

(2) Ber-lipo的生物相容性與安全性評估

為評估Ber-lipo的體外生物相容性，使用了RAW264.7細胞和HUVECs，并通過CCK-8、活/死染色和細胞骨架染色檢測其毒性。結果顯示，在2.5?40 μM濃度下，bergapten和Ber-lipo的細胞活性與對照組相似，但80 μM濃度的bergapten導致24%的HUVECs死亡，而Ber-lipo未表現(xiàn)出類似毒性，表明Lipo減輕了bergapten的毒性（圖3A-B）?；?死染色進一步證明了Ber-lipo在40 μM濃度下的良好生物相容性（圖3C-D）。體內實驗中，溶血試驗顯示Ber-lipo的溶血比率低于5%（圖3E），HE染色結果顯示心臟、腎臟、肝臟和脾臟組織無明顯病理變化，確認了其體內安全性（圖3F）。Ber-lipo的安全性源于其脂質體載體，尤其是DPPC成分，有助于藥物靶向肺部并減少毒性。

圖3 Ber-lipo在體內和體外均具有良好的生物相容性。(A、B) 分別在 RAW264.7 和 HUVEC 細胞中進行 CCK-8 測定。(C) HUVEC 中的活細胞/死細胞染色。 (D) HUVEC 中的細胞骨架染色。使用共聚焦顯微鏡。(E) Ber-lipo 的溶血率測定。(F) 使用 HE 染色對 LPS 誘導的 ALI 小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟進行組織病理學評估。

(3) Ber-lipo調節(jié)巨噬細胞極化平衡以改善ALI炎癥

研究人員通過評估Ber-lipo對M1/M2巨噬細胞極化的影響，發(fā)現(xiàn)Ber-lipo能夠有效維持巨噬細胞的極化平衡，從促炎狀態(tài)向抗炎狀態(tài)轉變。免疫熒光染色（圖4A）顯示，LPS刺激后M1型巨噬細胞標志物CD86表達增加，而Ber-lipo處理顯著減少，同時M2型巨噬細胞標志物CD163表達增加。流式細胞術結果（圖4B）表明，Ber-lipo處理后，CD86⁺ M1巨噬細胞比例從模型組的8.11%降至3.22%，而CD163⁺ M2巨噬細胞比例從25.9%升至73.1%。Western blot（圖4C & D）和qRT-PCR（圖4E-L）進一步證實，Ber-lipo減少了M1標志物及其炎癥因子的表達，增加了M2相關基因的轉錄水平。這些結果表明，Ber-lipo通過調節(jié)M1/M2極化，具有抗炎作用，可能對ALI及其他炎性疾病具有治療潛力。

圖4 Ber -lipo在體外對維持 M1 和 M2 巨噬細胞極化平衡的影響。（A）通過免疫熒光染色顯示 RAW264.7 細胞中 CD86 標記的M1 和 CD163 指示的 M2 的分布。（B）通過流式細胞術檢測 RAW264.7 細胞中 CD86 ⁺ M1 和 CD163⁺ M2 的比例。（C）通過蛋白質印跡法檢測 RAW264.7 細胞中 CD86 和 CD163 的蛋白質表達。（D）通過 imageJ 軟件對蛋白質條帶進行量化。 (E–L) 使用 qRT-PCR 標準化 CD86、iNOS、CD206、IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL22 和 CCL24 的 mRNA 表達。內部控制，α-微管蛋白。M1 表型標記：CD86、iNOS、IL-6、IL-1β 和 TNF-α。M2 表型標記：CD163、CD206、CCL22 和 CCL24

(4) Ber-lipo 對體外上皮和內皮完整性的保護作用

該團隊通過評估Ber-lipo對內皮和上皮屏障完整性的保護作用，特別是ZO-1蛋白的表達，探討其對ALI的修復效果。免疫熒光染色（圖5A）顯示，在MLE-12和HUVEC細胞中，模型組ZO-1蛋白（紅色）表達顯著減少、破裂或排列不規(guī)則，表明細胞通透性增加；而在bergapten和Ber-lipo處理組，ZO-1蛋白密封了細胞間隙，恢復了屏障完整性。進一步的Western blot分析（圖5B）顯示，模型組ZO-1表達顯著降低，而藥物處理組恢復了ZO-1的表達，Ber-lipo效果優(yōu)于bergapten。這些結果表明，Ber-lipo在體外能夠有效修復ALI引起的上皮和內皮屏障損傷。